细菌的基因重组

第五节细菌的基因转移和重组凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组（geneticrecombination），简称重组。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexualhybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。微生物中各种形式基因重组的比较重组范围供体和受体的关系整套染色体局部杂合高频率低频率部分染色体个别或少数基因细胞融合或联结性细胞真菌的有性生殖体细胞真菌的准性生殖细胞间暂时沟通细菌的接合性导细胞间不接触吸收游离DNA片段转化噬菌体携带DNA转导由噬菌体提供遗传物质完整噬菌体溶源转变噬菌体DNA转染基因重组的意义•基因重组是杂交育种的理论基础。•杂交育种的优点：•①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。•②利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。基因重组的意义•杂交育种的缺点：•由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。原核生物的基因重组原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。特点：①片段性，仅一小段DNA序列参与重组；②单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；③转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。（一）接合（conjugation，mating）供体菌（“雄性”）通过性毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子（conjugant）。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！AB[-][-]过滤器U型管实验•存在范围：–细菌：G–较为多见如E.coli(大肠杆菌)、Salmonella(沙门氏菌)、Shigella(志贺氏菌)、Serratia(粘质沙雷菌)、Vibrio(弧菌属)、Azotobacter(固氮菌)、Klebsiella(克雷白氏杆菌属)和Pseudomonas(假单胞菌属)等最为常见–放线菌：Streptomyces(链霉菌属)、Nocardia(诺卡氏菌属)–接合还可发生在不同属的菌种之间，如E.coli与Salmonellatyphimurium之间或S.typhimurium与Shigelladysenteriae之间大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性毛不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性毛F因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上F因子的四种细胞形式a）F-菌株，不含F因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性毛。接合的一般过程•接合时F+细胞与F–细胞相遇，性菌毛与F–细胞表面发生吸附而形成接合管；•F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂；•断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5’为先导通过性菌毛推入F–细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F–细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型（rollingcirclemodel）；•在F–细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链F因子。•至此，原来的F–菌株变成了F+菌株。原来的供体仍为F+菌株。（二）转导（transduction）通过病毒（defectivephage）的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子（transductant）。由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导流产普遍转导完全普遍转导1.普遍转导（generalizedtransduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。（1）完全普遍转导简称普遍转导或完全转导（completetransduction）。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内进行交换、整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转导子，这种现象就称普遍转导。Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）的野生菌株Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）的营养缺陷型突变株P22嗜菌体供体菌受体菌转导模型供体菌受体菌转导媒介—噬菌体误包转导颗粒普遍转导子双交换同源配对10-6～10-8过程：（1）P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10–6~10–8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。（2）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。（3）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。S.typhimurium的P22噬菌体、E.coli的P1噬菌体、Bacillussubtilis的PBS1和SP10等噬菌体都能进行完全普遍转导。供体菌转导媒介——噬菌体受体菌（2）流产普遍转导简称流产转导（abortivetransduction）。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。受体菌外源DNA细胞分裂外源基因经转录、转译而形成的少量酶获得外源DNA获得少量酶不断稀释特点：在选择培养基平板上形成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子。流产转导（abortivetransduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。2.局限转导（specializedtransduction，restrictedtransduction）指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。最初于1954年在E.coliK12中发现。特点：①只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；②该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；③缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（～10-5）“误切”（不正常切离，abnormalexcesion）或由于双重溶源菌的裂解而形成；④局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。局限转导低频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。E.coli的λ嗜菌体和φ80嗜菌体具有局限转导的能力。比较项目普遍性转导局限性转导转导的基因供体染色体或染色体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生的位置不结合在寄主染色体特定位置上结合在寄主染色体特定位置上获得转导噬菌体的方法通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌转导子的区别一般稳定，非溶原性（不表现出任何噬菌体的性状，包括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性状）普遍性转导和局限性转导的比较受体菌（recipientcell，receptor）直接吸收供体菌（donorcell）的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子（transformant）。（三）转化（transformation）1.定义原核生物Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Xanthomonas（黄单胞菌属）等。2.转化微生物的种类真核微生物Saccharomycescerevisiae（酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。①受体细胞要处于感受态.感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态②供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1×107D左右③菌株间的亲缘关系密切3、转化发生的条件感受态（competence）感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。感受态细胞（competentcell）具有摄取外源DNA能力的细胞。自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）感受态感受态受