基因工程原理3088

第四节DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制一．DNA的限制酶反应1.酶单位定义:使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。2.酶切反应类型1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)2)部分酶切3.酶切反应最适条件1)DNA分子的组成i.碱基组成与排列方式ii.识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍（如λ中的EcoRI位点）2)反应条件i.DNA溶液的纯度和浓度（反应浓度）依实验目的而定HpaI(CCGG)126ThaI(CGCG)023ii.限制酶的纯度和稳定性i)纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件ii)稳定性：保存和反应iii.反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液，不同温度下的pH值iv.反应温度：大多数为37℃v.双酶切和多酶切反应同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者--分别酶切。i)第一种酶切电泳检查酚/氯仿纯化第二种酶切。可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。ii)采用低浓度盐缓冲液的限制酶切电泳检查采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)二、限制酶图谱的绘制1.完全酶切作图法1）单酶切作图法一长度为5Kb的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。i.单酶部分酶切：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。ii.末端标记完全酶切DNA片段末端标记完全酶切凝胶电泳EtBr染色观察放射自显影2)双酶切作图法单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图根据上述的原理和步骤，前述的5Kb片段酶I与酶II的定位结果可用两种方法之一：i)单酶切分离DNA片段第二种酶切凝胶电泳ii)单酶切第二种酶切凝胶电泳*如果要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时，单酶完全酶切作图就没必要了。2.末端标记-部分酶切作图法（Smith-Brinstiel法）DNA片段末端标记酶1切分离带标记DNA片段酶2部分酶切电泳EtBr染色照相放射自显影结果单端标记方法:人工合成单端标记法限制酶切单端标记法单端标记方法1人工合成单端标记法单端标记方法2限制酶切单端标记法3.末端标记双相作图法方法2仍存在两个不足之处：①酶1的选择不能靠近DNA中央；②需先分离DNA片段，该法可克服上述缺点。现假设有一片段长10Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:4.Bal31顺序酶解作图法DNA片段Bal31处理不同时间取样终止反应限制酶切凝胶电泳染色观察结果5.切口移位作图法(可检测出100bp片段)双链DNA切口移位限制酶切电泳放射自显影6.大尺度限制酶作图1)条件i.电泳方法---脉冲场凝胶电泳ii.样品制备---原位DNA制备和酶解iii.人工染色体构建---pYAC载体构建iv.脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG序列存在2)一般作图程序原位DNA样品制备原位DNA限制酶切脉冲场凝胶电泳染色观察3)大尺度作图用酶i.稀有识别序列内切酶----I型内含子内切酶(真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)；酵母HO内切酶；大肠杆菌recA虽然这些内切酶识别的序列都很长：10-19bp，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用ii.II型限制酶人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5kb富含GC的DNA片段,其中只有25%的CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基因的5’-端,未被甲基化的CpG岛平均长约270kb可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列i)AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGCii)FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGCiii)SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGGvi)NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3三.限制酶图谱的用途1.基因工程中的应用1)克隆载体图谱,便于DNA重组;2)克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序.2.突变体检测遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了基因型和表型的变化.限制酶图谱不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了变化,但不一定发生了表型变化,即表型的变化不一定会导致酶谱变化.1)缺失突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较小DNA片段.2)插入突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较大DNA片段.缺失和插入突变体的检测（I）III点突变的检测（II）3）点突变的检测:某DNA片段消失,代之以两较小的DNA片段.前者的长度等于后两者长度之和(位点增加)；某两DNA片段消失,代之以一较大DNA片段，前者的长度之和等于后者长度(位点消失).3.重组频率的测定同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗传多型性.等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制酶片段长度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不同个体总DNA限制酶完全酶切Southern印迹杂交结果分析当不同个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不同果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为:表型红:白=1:1,限制酶谱30%个体已发生了重组.4.遗传疾病的诊断分析正常人与遗传病患者的某些DNA片段的限制酶谱,便可发现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病.第五节DNA的连接一.DNA的连接方法两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构.1.直接连结法---该法适用于:1)同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外(如AraI)2)不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI3)PCR产物与特定载体的连接4)限制酶和其他方式产生的平整末端.2.人工接头连接法1)人工接头（linker）的结构i.中轴对称互补,可自行退火形成双链.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶识别位点iii.某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如:八聚体d(GGAATTCC)十聚体d(CGGAATTCCG)十二聚体d(CCGGAATTCCGG)2)用途i.平整末端的连接(各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火ii.产生新的克隆位点iii.合成匹配接头3)连接方法人工接头磷酸化退火形成双链与目的DNA相连限制酶切两DNA分子相连4)适用范围人工接头连接法适合于那些只有一种DNA片段需加人工接头就可以与另一DNA分子相连的DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端的DNA分子相连.这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的DNA可能具有不同的结构.为避免这些结构的产生,可先使一种DNA先加上人工接头后,再与另一种DNA分子相连.3.匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)匹配接头的结构特点i.由两个低聚核苷酸组成ii.部分区域可以互补iii.退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2)匹配接头的种类i.预制匹配接头(连接平端和粘性末端)人工接头+匹配接头预制匹配接头ii.转换匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)二匹配接头退火转换匹配接头二人工接头连接酶双酶切转换匹配接头iii.单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾连接法在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC.5.连接方法的选择方法选择的依据:1)两DNA分子的末端结构2)DNA分子的限制酶谱3)是否需要回收DNA片段连接方式的选择载体末端外源DNA末端常规连接脱磷酸化同聚物平端连接补齐,人工接头结构结构载体加尾外切酶5’-突起相容5’-突起第二选择第一选择不能不能不能5’-突起非相容5’-突起不能结合使用接头不能不能第一选择3’-突起相容3’-突起唯一选择不能不能不能不能3’-突起非相容3’-突起不能不能第一选择不能第二选择或平端3’-突起5’-端突起不能不能第一选择不能第二选择(补齐后)平端平端不能可能可能第一选择可能平端3’-或5’-突起不能不能第一选择不能第二选择二.DNA的连接反应1.连接反应理论当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关:1)连接反应系统中的总DNA浓度i2)一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j,该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化)3)两种不同DNA分子的克分子浓度之比值.2.连接反应条件1)评估连接反应结果的方法i.琼脂糖凝胶电泳ii.大肠杆菌转化2)反应条件i.温度ii.ATP浓度iii.时间iv.连接酶浓度v.克分子比率第六节PCR技术一．DNA体外扩增技术1.PCR反应体系1)基本原理(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应)一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物2)基本操作待扩增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液+两引物90℃变性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′进入第二次循环25-30次循环90℃变性解链与引物退火，50℃引物及延伸，75℃n次扩增第一次循环第二次循环3'5'3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'3'3'5'3'3'5'5'5'3'5'5'3'90℃变性解链与引物退火，50℃5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'引物及延伸，75℃3'3'5'3'3'5'5'5'3'3'5'3'3'5'5'5'PCR原理示意图2.PCR产物的鉴定1)PCR产物的大小和限制酶谱分析bpbp500100600500100RE2)寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）OR分析对于PCR产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用GACTCCTGGCTGAGGACCAT3'3'GACTCCTGGCTG