ASTM-E-2149-01-在动态接触条件下测定稳态抗菌剂的抗菌行为

ASTME2149-01在动态接触条件下测定稳态抗菌剂的抗菌行为1范围（1）该测试法用于评价非溶出型抗菌试样在动态接触细菌的条件下对细菌生长的抑制行为。该法克服了采用经典抗菌测试法时所存在的困难，如AATCC100中要确保样品与培养液表面紧密接触、AATCC147中不合理静态条件的应用以及灵敏性、重现性问题等。该法可用于测定多种污染物。（2）通过从测试样到同步运行控制的结果对比来测定表面的抗菌活性；（3）通过抑菌区出现的前后来测定溶出抗菌剂的存在。2参考文献（1）ASTM标准E1054评价了抗菌剂在消毒剂、食品加工用消毒杀菌剂、产品的防腐或保存中的抑菌行为；（2）其他文献AATCC147-1998，织物抗菌活性的评价：平行条纹法；AATCC100-1999，织物抗菌性的整理。3原理稳态抗菌剂（如表面粘结材料）在常规使用条件下并不容易扩散到周围环境中，如AATCC147测试法直接依赖于抗菌剂从处理样品中的迅速溶出性，而其中这些处理样品并不适合用于评价稳态抗菌剂的抗菌活性。该法通过在测试过程中不断搅拌放在细菌悬浮液中的测试样以保证细菌与处理纤维、织物或其他基底的良好接触。该测试法适用于评价在充分条件控制下的受压或修饰的样品。注：上述的受压可包括洗烫、穿、摩擦、辐射、蒸汽灭菌、紫外曝光、溶剂处理、热传感或类似的物理或化学处理。4强调及使用基底束缚的抗菌剂的抗菌活性取决于细菌和活性化学剂间的直接接触。该测试法通过振荡在一定浓度细菌悬浮液中的表面束缚材料样品（样品与细菌接触时间为1h或由调查者指定时间）。悬浮液连续稀释2次，可以测定悬浮液中活的有机物的数目，细菌的减少率可基于起始的数目或未经处理的空白样上的细菌数目进行计算。注：该测试法用于在指定接触时间下具有50％-100％还原活性的表面。5仪器（1）灭菌器（2）培养皿（3）分光光度计（4）振荡瓶－可采用WristAction振荡瓶，但带有其他搅拌方式的振荡瓶对于常规的测试也可使用。振荡瓶必须保证充分的搅拌，不宜用旋转型振荡瓶。（5）水盆（6）漩涡混合器（7）玻璃器具：接触瓶－250ml厄伦美厄瓶，带塞，能经受住压热器的作用稀释管；吸液管（8）琼脂：孔径为8mm6试剂6.1缓冲溶液－对于需要改变体系PH值的测试样，可用PH＝6.8的索楞逊磷酸盐作为缓冲液。采用其他适宜的缓冲液必须保证测试前在指定使用的浓度下不会引起细菌数目的增加或减少。0.25MKH2PO4储存缓冲液：至少每6个月制备一次新溶液如下：称取34±0.1g的KH2PO4固体于100ml烧杯中，加入500ml蒸馏水，用稀释的NaOH溶液溶液调节PH=7.2±0.1，稀释至1000ml，转移到容量瓶中，4℃保存；对于工作用缓冲液（0.3mMKH2PO4）：至少每2个月制备一次新溶液如下：用无菌吸液管转移1ml±0.1ml储存缓冲液于含有800ml蒸馏水的容量瓶中，加盖，灭菌。6.2媒介：营养肉汤或其他有机体可选用的适宜媒介；蛋白胨葡萄糖膏琼脂或其他有机体可选用的适宜媒介；6.3润湿表面活性剂－测试前在指定的浓度下不会引起细菌数目的增加或减少。注：0.01%的MIQ2-5211最终稀释液或其他等价物。7测试有机体Klebsiella肺炎菌或其他由调查者决定的有机体：测试有机体的培养液应根据良好的微生物实践、纯净度检查以及基于常规基础之上来保持。测试的一致性及准确性要求测试用培养液要纯净、无污染。在制板、转移等过程中采用良好的无菌技术来避免污染。通过严格执行每一个月转移一次储存液来避免基因突变或逆转。通过定期制备条纹平板和观察具有单一种群特征的细菌群来检查培养液的纯净度。注：Klebsiella肺炎菌肉汤培养液中出现光泽表明出现逆转，此时培养液不能再用。8参数（1）必须指定所用的有氧呼吸的有机体以及接触的时间；（2）表面的制备或调湿也必须按照规定，为了在预期时间内能够显示最大的抗菌活性，测试样的预处理必须记录下来并和相同的处理控制相比较；（3）必须指定测试样的重量、大小以及结构材料；（4）所制备的样品要能使搅拌达到最大值，其可记录的比表面积可反映出测试的浓度；（5）润湿性表面活性剂必须用于高非亲水性样品。9细菌接种体的制备（1）每一系列样品所用的Klebsiella肺炎菌培养液均在无菌营养肉汤中生长18h。若指定用其他的有机体，则也应采用同样的方式制备，除非规定了其他的媒介和不同的标准技术。（2）用无菌缓冲液稀释培养液直到溶液在475nm处的吸光度为0.28±0.01（用分光光度计测定），此时的浓度为1.5-3.0×105CFU/ml此溶液即为后面要用的细菌稀释液。注：对于其他的有机体，通过合适的方法调整最后的浓度为1.5-3.0×105CFU/ml。10测试样的制备（1）织物和纸张－样品由调查者决定所选的重量，称至±0.1g；注：重量一般在0.5－2.0g，必须保证在接触期有强烈的搅拌。样品应切得足够小以保证最大程度的搅拌，且样品大小要一致（处理样与空白样）。样品的聚集会影响结果的重现性。（2）粉末状与粒状材料－称至±0.1g，材料在振荡后需放置一段时间以保证样品不会受到恢复和计算技术的干扰；（3）其他固体（表面处理）－减小固体的大小以适合瓶子或无菌广口瓶。使用处理表面积大小为58cm2的样品。同样由调查者决定所选的重量，称至±0.1g。振荡过程一定要小心以防止瓶子破裂。未经处理的固体样不应吸附溶液。为了测试容器的需要，测试样可以设计称封条状以保证只有处理过的表面才与接种体直接接触。注：其中固体样品是指：塑料、玻璃珠或碎片、陶瓷、金属碎片或类似的硬质表面。11测试程序11.1准备表面结合有抗菌剂的被测样，要求每个测试样都要相应有一块未经处理的空白样作为对照。11.2除了一份只有接种体的样品外，再为每个处理样及空白样准备一个250ml的带螺帽的厄伦美厄接触瓶。若一系列正在运行中，则再为每个样品及每种类型的样品各准备同样的接触瓶以作为检查标准用试样。往每个瓶子中加入9（2）中制备的细菌稀释液50±0.1ml。11.3盖紧瓶子并把它们放入一个WristAction振荡瓶中，以最大速度振荡1分钟±5秒，每个接触瓶均认为接触时间为“0”。通过采用一系列的稀释液和标准平板计算技术，在“0”接触时间时测定溶液的细菌浓度。系列的测试瓶一定要大，并要求在接触后第一个与最后一个稀释液时间间隔不超过5min。注：为保证抗菌剂不残留在溶液中，可采用含有缓冲稀释液的中和剂（见E1054）11.4一旦“0”接触时间的子样制备好了，将测试样及检查标准用试样放入它们各自的接触瓶中，盖上盖子，放入振荡瓶中，以最大速度振荡1小时±5分钟（除非有指定不同的接触时间）。立即从每个接触瓶中转移1±0.01ml到测试管中，各连续稀释复制成2份作为“0”接触时间的子样。注：（1）调查者可以在任何与测试有机体相一致的设定温度下进行实际的振荡操作，温度反映出样品的最终使用及良好的微生物程序；（2）样品上残留的细菌可通过采用合适的技术如琼脂印迹测试法或缓冲提取法和平板计算技术来进行计算。11.5允许所有子样培养皿培养24－48h。11.6计算每个培养皿中的细菌群数，记录数值，取两个复制培养皿的平均值，并将平均值转换成CFU/ml（即瓶中每ml缓冲液中细菌群构成）。注：（1）若两个复制子样培养皿中所得数值相差超过15％，则放弃该样并重新测试。（2）原始测试有机体的存在可以通过革兰氏染色法和种群形态学来证实。11.7用以下公式计算用于与样品接触而引起有机物的减少率。结果可采用减少百分数的形式（当测量采用CFU/ml时）或死亡率常数（当采用平均log10（细菌密度）计算时）：减少率，％（CFU/ml）＝【（B-A）/B】×100死亡率常数（平均log10密度）＝B-AA：CFU/ml或平均log10细菌密度（对于在指定接触时间之后含有经处理基质的接触瓶）；B：“0”接触时间的CFU/ml或平均log10细菌密度（对于在加入经处理的基质之前的接触瓶）11.8在指定接触时间后瓶中仅含有检查标准用接种体的计算值（C）与含有在指定接触时间后未经处理的检查标准用试样的计算数值（D）不得超过15％，此时，有机物的减少率直接用经处理样（A）/未处理的检查检查标准用试样（D），将B换成D重复上述公式并记录。C：CFU/ml或平均log10细菌密度（对于在指定接触时间之后仅含有检查标准用接种体的瓶子）；D：CFU/ml或平均log10细菌密度（对于在指定接触时间之后含有未经处理培养基底的瓶子）；注：若未经处理的织物检查标准用试样不可用，并且在接触时间之后仅含有检查标准用试样接种体瓶子中计算数值与原始测量数值相差超过15％，则需重新测试。11.9若死亡率常数达到预期效果，记录并报道最接近的百分数的一半或十分之一的平均log10细菌密度。12溶出型抗菌剂行为测定程序12.1样品分析采用AATCC147-1998测抑菌区是否出现；12.2表面分析（1）采用汇合的菌苔（即均匀生长于固体培养基上的）接种蛋白胨葡萄糖膏琼脂平板或适宜的琼脂作为测试有机体，并允许干燥；（2）中心孔径为8mm的接种琼脂平板，并除去塞子；（3）按10节中准备测试样，要求每块样品都要有一块未经处理的空白样；（4）准备2个含有50ml无菌缓冲液的250ml的无菌接触瓶；（5）把测试样与检查标准用试样均放在它们各自的瓶子中，盖紧瓶子，放进振荡瓶，按11.4中规定时间进行振荡；（6）从每个测试瓶中取10μl溶液倒入琼脂孔并允许干燥，每块接种用平板均放置于37±2℃；（7）记录和报告在8mm直径孔周围抑菌区是否出现，若有则表明有溶出；注：若任意一个测试样中均有抑菌区出现，则表明所用样品对于该法不适用。