口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建

中国农业科学2008,41(11):3801-3808ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2008.11.048收稿日期：2007-06-21；接受日期：2007-12-12基金项目：国家“十一五”科技支撑计划（2006BAD06A11）作者简介：蒋韬（1975-），女，江苏武进人，博士研究生，研究方向为分子病毒学与免疫学。E-mail：[e-mail]。通讯作者刘湘涛（1942-），男，湖南祁东人，研究员，研究方向为动物病毒病分子流行病学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立蒋韬，梁仲，陈涓，何继军，吕律，马维民，刘在新，刘湘涛（中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州730046）摘要：【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法（GICA）。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒，标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72andAsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上，作为检测带与质控带。经试验条件优化，组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度，可检测到7.8×104LD50（1﹕128倍稀释乳鼠毒）的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同，说明其有较好的重复性；特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原，如猪水疱病抗原（SVD）、水泡性口炎（VS）、水泡性疹（VES）等病毒时无交叉反应；试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验，O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法，对基层现场具有广泛应用价值。关键词：O、A、AsiaI型口蹄疫病毒；胶体金；免疫层析法DevelopmentofaRapidGoldImmunochromatographicStripTestfortheDiagnosisofFoot-and-MouthDiseaseVirusO,AandAsiaⅠTypeJIANGTao,LIANGZhong,CHENJuan,HEJi-jun,LÜLü,MAWei-min,LIUZai-xin,LIUXiang-tao(KeyLaboratoryofAnimalVirologyofMinistryofAgriculture/StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgrcultrualSciences,Lanzhou730046)Abstract:【Objective】Todevelopasensitive,rapidandsimplegoldimmunochromatographyassay(GICA)fordeterminationoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)O,A,AsiaItypefromthefieldsamples.【Method】Thepurifiedanti-FMDVO,A,AsiaItypeGuineapigantibodywerecoupledwiththecolloidalgold,anditwasobtainedbyreducingthegoldchloridewithsodiumcitrate.Thepurifiedanti-FMDVstrainO/China99,A/AF72andAsiaⅠ/China05rabbitantibodyandthegoatanti-GuineapigIgGwerewrappedontonitrocellulosemembraneasthetestline(Tline)andthecontrolline(Cline).TheFMDVserotypingdiagnosiskitwasthenperformedbyfurtheroptimizationofthelabelingandtheconditionsweredetermined.【Result】Theseriateresultsindicatedthatthesensitivityofthetestkitreached7.8×104LD50.(1﹕128dilutionmousetissuevirus)andithadthesameresultsforpositiveandnegativespecimenstestedinthreetimes.NocrossreactionwasfoundwithSwinevesiculardisease(SVD),VS,VESantigenbycrosstests.Intheclinictest,atotalof206fieldsampleswerecomparativelydetectedwithGICA.ThecorrespondingrateofgoldimmunochromatographicstriptestkitforFMDVO,A,AsiaItypeandnegativesamplewas92.45%,91.66%,92.75%and100%.ThecorrectrateofdetectedFMDVserotypewas94.58%.Thisstripcouldbestoredat4℃for6months.【Conclusion】Inthisstudy,theestablishedgoldimmunochromatographicstriptestkitissimple,rapid,sensitiveandspecificfordetectingFMDVO,A,AsiaItype,andispotentiallyusefulforthefirsttimeandon-the-spotdiagnosis.Keywords:FMDVO,A,AsiaItype;Colloidalgold;Immunochromatographytest3802中国农业科学41卷0引言【研究意义】口蹄疫（foot-and-mouthdiease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄类动物共患的急性、热性、接触性传染病。世界动物卫生组织（OfficeInternatinaldesEpizooties，OIE）将其列为A类传染病之首[1]。从口蹄疫参考实验室（OIE/FAOWorldReferenceLaboratoryforFoot-and-mouthdiease，WRLforFMD）对疫情通报统计，O型的流行最为广泛（世界范围内），其次为AsiaⅠ和A型，C型和南非三型非常罕见，通常只在特定区域流行[2]。快速、准确的的病原学诊断是控制口蹄疫疫情蔓延和追踪疫源的重要环节。它可使一线防疫人员在疫情暴发时对现场做出正确的诊断，及时确定病原、切断传播途径、采取有效的防范措施。【前人研究进展】目前，在世界口蹄疫参考实验室口蹄疫病毒检测及定型的常规方法仍是ELISA、病毒分离、RT-PCR等方法[1,3]。这些方法不仅需要一定的仪器设备和有实验技能的人员操作。而且操作复杂，过程繁多，检测用时长，成本高。胶体金免疫层析技术（agoldimmunochromatographicassayGICA）[4,5]是20世纪90年代以来在胶体金标记技术、免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。由于运用可目测的标记物（胶体金或染色乳胶）而得到直观的实验现象（显色），使得这种分析技术具备操作快速简便，无须仪器，结果准确、灵敏，可常温下运输保存等优点，已广泛应用于生物医学等各个领域。该技术在动物医学领域应用起步较晚，已报道的口蹄疫快速诊断技术研究，主要与口蹄疫抗体[5]和病原定性[6,7]诊断有关，而将胶体金免疫层析技术应用于口蹄疫病原多血清型诊断的研究尚未见报道。【本研究切入点】本研究针对现今FDMV定型技术操作繁复，难以应用于基层、田间口蹄疫病原的确诊，同时根据国际口蹄疫流行状况，选择O、A、AsiaⅠFMDV标准株和流行株抗体，利用免疫胶体金技术建立了口蹄疫病原定型诊断方法，首次研发了具有自己知识产权的FMDV定型快速诊断试剂盒。【拟解决的关键问题】试剂盒的应用为口蹄疫的病原定型诊断提供一种快速、简便、特异、实用的检测方法，解决现有诊断技术确诊时间长，难以推广的现状，为FMDV的快速诊断提供了新的手段。1材料与方法1.1血清、病毒标本口蹄疫多抗血清：FMDV/O、A、AsiaI/Russia58/（标准株）豚鼠高免血清和FMDV/O/China99、A/AF72、AsiaI/China05流行株兔高免血清；阳性参考样本：FMDV/O、A、AsiaⅠ、C/标准株乳鼠组织抗原；阴性参考样本：猪水泡病病毒（SVDV）、水泡性口炎（VS）、水泡性疹（VES）抗原和健康乳鼠组织；田间及试验样品标本（206份包括水疱皮、水疱液、乳鼠组织、O/P液、细胞培养毒）；均由兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室提供。1.2试剂HiTrapDesalting、DEAE-Sephrose层析柱：AmershamPharmaciaBiotech公司产品；兔抗豚鼠二抗、氯酸金（H4AuCl4·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司产品；聚乙二醇20000（PEG）：日本进口分装；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）等试剂均为国产分析纯。FMDV/O、A、AsiaI琼扩抗原：兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室提供。1.3材料及仪器硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水纸、玻璃纤维：Schleicher&Schuell公司产品；XY3000喷膜机、CM3000切条机：美国Bio-Dot公司产品；CARY50紫外2可见分光光度仪：产自日本岛津；PharmaciaFPLC纯化系统：瑞典Pharmacia公司；TGL216G台式高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂产品。1.4口蹄疫多抗血清的纯化将标准株和流行株O、A、AsiaI口蹄疫高免血清首先用硫酸铵盐析粗提，再用DEAE-Sepharose离子交换层析柱进一步纯化[8]，SDS-PAGE法鉴定纯度[9]，紫外分光光度法确定蛋白的含量，双相免疫扩散法测定纯化抗体效价[10]。1.5胶体金的制备采用柠檬酸钠还原法[11]制备胶体金。透射电镜（TEM像）观察金颗粒大小，检测OD523nm吸收值确定胶体金浓度。1.6免疫胶体金制备1.6.1IgG最适用量的选择按照文献[12]进行，确定FMDV/O、A、AsiaI/标准株/豚鼠IgG最适标记量分别为45、40、60µg·ml-1。1.6.2IgG最优pH的选择取胶体金5ml，用0.1mol·L-1K2CO3调节金溶胶pH，分别为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5后，按最佳标记量分别加入FMD标准株豚鼠纯化抗体，搅拌10～15min。加入5%BSA至终浓度为1%，搅拌5～15min，制成不同pH的金标11期蒋韬等：口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立3803FMDV抗体，并在检测波长OD523nm下，取其光吸收值最高时的pH做为胶体金与FMD标准株豚鼠纯化抗体的最佳结合pH。确定O、A、AsiaⅠ型标准株豚鼠IgG最适pH分别为7.5、9.0、8.0。1.6.3O、A、AsiaⅠ免疫胶体金的制备根