核酸含量的测定——紫外吸收法

核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（-C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右。常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。RNA的ε(P)260nm（pH7.0）为7700～7800，RNA的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μgRNA的光吸收值相当于0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P)260nm（pH7.0）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μgDNA钠盐的光吸收值相当于0.020。测出260nm处的光吸收值，可计算出核酸的含量。当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。从A260/A280的比值可判断样品的纯度。纯RNA的A260/A280≥2.0；DNA的A260/A280≥1.8。当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。RNA和DNA的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。pH对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH值。本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入1.0mLDNA/RNA样液，然后向甲管加入1.0mL蒸馏水，向乙管加入1.0ml过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min，使沉淀完全。3000r/min离心10min，各吸取上清液0.5mL转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL。以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A260值。2、计算试液中DNA/RNA总含量按下式计算：DVAAgDNA总乙甲020.0)(660660DVAAgRNA总乙甲022.0)(660660式中甲A260——被测稀释液在260nm处的总光密度值；乙A260——加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液在260nm处的光密度值；两者之差（甲A260－乙A260）为被测稀释液的光密度值；VB——被测试液总体积（mL）D——样液的稀释倍数。0.020——脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升含1μgDNA钠盐的水溶液（pH为中性）在260nm波长处，通过光径为1cm时的光密度值。0.022——核糖核酸的比消光系数，是浓度为1mg/L的核糖核酸水溶液（pH为中性）在260nm波长处，通过光径为1cm时的光密度值。由于大分子核酸易发生变性，此值也随变性程度不同而异，因此一般采用比消光系数计算得到DNA或RNA量是一个近似值。