单克隆抗体

第七章抗体类药物一、概述二、抗体分子的结构三、抗体类药物的分类四、治疗性单抗研制进展3抗体的概念：定义一：抗原诱导由淋巴细胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和结构的免疫球蛋白分子(lg)。定义二：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。一、概述4人体中主要的抗体及性质5抗原抗体由抗原诱导产生，抗原是抗体药物的靶分子。抗体所针对的抗原可包括：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人体疾病相关基因及其编码的蛋白。各种病原体如病毒、支原体、细菌、原虫、寄生虫。（一）、抗体分子结构轻链（Lightchain）上有一个轻链易变区（Variableregionoflightchain，VL）及一个轻链恒定区（Constantregionoflightchain，CL）。重链（Heavychain）有一个重链易变区（Variableregionofheavychain，VH）及3-4个重链恒定区（CH1-CH4）。9抗体多样性体细胞突变，B细胞分化过程中点突变可反复进行，使分化中的B细胞受抗原压力选择体细胞内重组基因转换核苷酸掺入抗体多样性-抗体编码基因较多轻链L编码区由V、J和C区组成，其中V、J组成可变区11抗体多样性重链H编码区由V、D、J和C区组成，其中V、D、J组成可变区12抗体多样性Lg分子氨基端L链1/2与H链的1/4区段的氨基端组成及排列顺序多变，称为可变区（V区）。Lg分子氨基端L链1/2与H链的3/4区段的氨基端组成及排列比较恒定，称为恒定区（C区）。可变区中互补决定区CDR具有很大的变异性，而恒定区中FR保守。FR1FR2FR3CDR1CDR2CDR3H2NCOOH13抗体独特性编码重链和轻链的基因重排后，进行表达生成细胞表面受体并能与抗原发生作用。只有这些Bcell表达的表面Lg与一个外源抗原结合后才会引发进一步的反应。在这些识别过程中将自身抗原识别掉排除。识别外源抗原的Bcell被诱导增殖并分泌抗体，在此过程中，可变的结构域CDR的特定部位被诱导发生随机突变，Bcell在反向于那些与抗原有高亲和力的突变抗体的分泌。这个过程非常高效，使免疫系统具有产生对抗任何外来分子抗体的能力。可变区这种独特的装配方式叫做抗体的独特性14（二）、抗体的主要作用结合抗原中和毒素促进吞噬功能1.特异性地结合抗原(SpecificcombineAg)是由V区（尤其是V区中的超变区）的空间构型决定的，是可逆的，并受到pH、温度和电解质浓度的影响。①aa极大变化的超变区（Hypervariableregion，HV）或互补决定区（Complementaritydeterminingregion，CDR），CDR1—CDR3（各5—16aa）：可特异性结合Ag；②框架区（Frameworkregion，FR）：为β片层结构，aa序列相对稳定，不与Ag直接结合。攻击病毒凝集细菌2.活化补体(Activatecomplement)IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通过经典途径活化补体。凝聚的IgA、IgG4和IgE等可通过替代途径活化补体。3.结合Fc受体(CombinedFcreceptor)不同细胞表面具有不同Ig的Fc受体，分别用FcγR、FcεR等表示。当抗体与相应抗原结合后，由于构型的改变，其Fc段可与具有相应受体的细胞结合，发挥不同的生物学作用：（1）介导Ⅰ型变态反应IgE与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI结合，发生脱颗粒，引起Ⅰ型变态反应。（2）调理吞噬作用①抗体在抗原颗粒与吞噬细胞之间“搭桥”，加强了吞噬细胞的吞噬作用；②抗体与相应颗粒性抗原接合后，改变抗原表面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥力；③抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质；④吞噬细胞FcR结合抗原抗体复合物后，吞噬细胞可被活化。抗体介导的调理作用（3）发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用）当IgG抗体与带有相应抗原靶细胞结合后，可与嗜中性粒C、单核C、巨嗜C、NKC等效应C结合，发挥ADCC作用。NK细胞介导的ADCC作用4.通过胎盘(Throughplacenta)在人类，IgG是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的Ig，是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。抗体的功能（三）、抗体分子的治疗作用各种抗体被广泛地应用于疾病的的诊断、预防及治疗：1、在体外诊断上，用于检测各种抗原，包括感染性病原体抗原、血清肿瘤可溶性抗原、细胞表面抗原、受体、激素、神经递质、细胞因子等。2、在肿瘤检测方面，同位素标记的单克隆抗体可与肿瘤组织表面的抗原结合，起到免疫扫描、免疫成像的作用，优于超声波和核磁共振。3、在预防方面，抗体主要可用于感染性疾病的预防，如流感、乙肝等。1.抗体的治疗机制（1）中和作用(Neutrilization)用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。（2）示踪或导向作用（Tracerortargetedeffect）使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。（3）竞争性抑制作用/拮抗作用(Competitiveinhibition)与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害。（4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（Abdependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（Complementaritydependentcytolysis,CDC）。（5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性。2.抗体的治疗应用随着抗体制备技术的进步，治疗性抗体已逐渐从实验室走向临床，并在多种疾病的治疗方面展示了光辉的前景。（1）抗肿瘤作用(Anti-tumor)由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现，自从1978年成功制备第一株抗黑色素瘤单抗以来（Steplewski1979），出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体，并于1980年首次在美国开展了单克隆抗体肿瘤治疗的临床试验。1983年Miller等报道了一例经单克隆抗体治疗的淋巴瘤患者，在放疗、化疗及干扰素治疗后，使用单克隆抗体治疗存活超过了4年。单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：①抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。②单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗。③单抗给予T细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（tumorspecificcytolyticTlymphocytes，TS-CTLs）可用于特异性、被动性的免疫治疗。（2）抗感染作用(Anti-infection)应用疫苗、免疫球蛋白，预防和治疗感染性疾病。（对不能获得相应疫苗的病毒感染，AIDS及一些危重情况，如内毒素休克等则无效）被动抗体疗法主要机制是中和病毒，并已证明抗体在体外及体内中和病毒的效应不依赖于Fc介导的功能和双价的存在，但可能受抗体亲和力影响。（3）抗器官移植排斥反应(Anti-repellingoforgantransplant)抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，预防排斥反应发生。Tc共有的分化抗原CD3（Clusterofdifferentiation）分子及IL-2R对T细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗CD3及抗IL-2R工程抗体的研究较为多见。（4）抗血栓形成封闭血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa整合素受体，是血栓性疾病治疗上的突破（Tubeliverst1999）。近年来许多关于抗GPⅡb/Ⅲa单抗C7E3的研究表明，C7E3能对90%以上的受体产生阻断效应，减少了35%高危的经皮腔冠脉介入治疗（PTCA）后缺血性并发症及27%6个月内的临床再狭窄的发生，并证明C7E3能预防动脉但不能预防静脉的血栓再形成。（5）解毒(Detoxicating)对药物或动物毒素中毒患者，免疫治疗是应用抗该药物或毒素特异性抗体或其片段。抗体与毒素形成复合物，改变了毒素的药物动力学，使毒素与受体解离，从其结合部位呈梯度流出，进入血循环中。这种方法对强心苷中毒有明确疗效。基因工程抗体对百草枯及蛇毒中毒也有一定作用。（6）构建抗独特型抗体疫苗(Constuctionofanti-idiotypevaccine)抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟抗原（内影像作用）而发挥效应。据此构建的独特型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗原，能诱导抗肿瘤免疫反应。（7）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用（applytoimmunitydiseaseandabnormalityreaction）自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。利用基因工程技术制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用；或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。针对不同发病机制，治疗方法趋于多样化。许多变态反应与IgE有关。Fcε片段可与变应原特异性IgE竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。还可生产出与患者IgE竞争结合变应原的Fab样分子。三、抗体类药物分类第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体第四代：单域抗体抗体技术的发展经历了四个阶段指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。1、多克隆抗体(polyclonalantibody;pcAb)123AgAxyzAgB1’20AgA’12322pcAb的制备多价抗原致敏B细胞传统抗血清所有抗体混合对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白条带缺失（c）。a1a2b白蛋白球蛋白（c）（a）（b）实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等，副作用：超敏反应。（2）临床诊断，如：肥达氏反应---伤寒、副伤寒，缺点：特异性差。2、单克隆抗体（mAb）可生产有用抗体的淋巴细胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生长产生专一性抗体一个Bcell只产生一种抗体●一个B细胞只能生产一种抗体，针对某一抗原决定簇。●若有许多抗原决定簇，则需许多株B细胞分别生产许多抗体。BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原决定簇单抗制备的流程图49单克隆抗体的概念杂交细胞：在诱导物的作用下同一细胞或不同细胞间的融合，融合的细胞具有双亲本细胞的染色体和全部或部分特性。杂交瘤细胞：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后产生的杂交细胞。单克隆抗体：具有分泌抗体能力的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体。50单克隆抗体的特点多克隆抗体的不足：假阳性、制备困难、产量低。单抗中抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同。单抗具有高度的特异性。产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体。实际意义：（1）抗原的纯化和结构分析；（2）细胞发生、分化及功能的阐明；（3）临床疾病的诊断和治疗，如：免疫分子检测；免疫导向药物治疗恶性肿瘤McAb抗癌药物(毒素或放射核素偶联)多克隆抗体单克隆抗体来源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低组成针对不同抗原表位的抗体的混合物针对单一表位，结构和组成高