chip试剂盒17-371说明书翻译

CHIP步骤实验前准备：·处理细胞，将细胞保持在装有20ml培养基的150mm培养皿中。·冰预冷PBS（第3步）、培养皿（第六步）。·每个150mm培养皿准备42ml1*PBS(10*PBS4.2ml+水37.8ml),冰上预冷。·预热SDS到室温，确保在细胞裂解之前彻底溶解。·将proteaseinhibitorcocktailII放置室温待用。A体内交联和溶解1、加550μl37%的甲醛（或1.15ml新鲜的18.5%甲醛）到20ml细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。·甲醛的终浓度为1%。尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。2、室温下孵育10min。·不要振荡细胞。3、取2ml冰冷的1*PBS于分离管中至于冰上（每个培养皿对应一个），每1mlPBS中加5ulProteaseInhibitorCocktailII。4、加2ml10×Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。5、晃动混匀并在室温下孵育5min。6、将培养皿放在冰上。7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。8、加20ml冰冷的1*PBS来洗涤细胞。9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。10、加2ml含1×ProteaseInhibitorCocktailII的冷PBS到培养皿中(从第3步得)。11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。12、4℃，700g（900~1000rpm）离心2~5min沉淀细胞。13、准备好1ml(1*107个细胞推荐1ml)SDSLysisBuffer（含5ulProteaseInhibitorCocktailII）。14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80℃中保存）。15、用准备好的1mlSDSLysisBuffer(含1*ProteaseInhibitorCocktailII）重悬细胞。16.能整除300~400ul的微型管。（溶解产物可放在-80储存）17如果超声条件理想直接进行B部分，否则查看附录A。B超声断裂DNA实验前准备：·选择最佳的超声条件来打断交联的DNA，使其长度为200~1000bp（查看附录A）。1、需要的话，从步骤A-16中取5μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。2、在冰上超声处理细胞裂解液。（条件摸索）3、4℃10000~15000g（~12000rpm）离心10min除去不溶解的沉淀。4、有需要的话，可以取出5ul打断的DNA电泳检测超声效果。5、将上清液吸到一个新的离心管中，100ul一份。·每100μl包含106个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。·打断的交联染色质可以在-80℃中保存2个月。C、Immunoprecipitation(IP)ofCrosslinkedProtein/DNA实验前准备：·取出ProteaseInhibitorCocktailII在室温融化（步骤3用）。1、准备足够的DilutionBuffer（含proteaseinhibitors），放在冰上。·每个IP实验需要900ulDilutionBuffer和405ulProteaseInhibitorCocktailII。·测试样品包括：阳性对照Anti-RNAPolymeraseII，阴性对照NormalMouseIgG，和自己实验用的抗体。建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。2、准备一个微型离心管包含100ul打断的交联好的染色质(B-5)放在冰上。·若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将1.1ml样品放在一管中进行实验。·每100ul包含1*106细胞来做免疫沉淀。3、加900ulDilutionBuffer（含ProteaseInhibitorCocktailII）到100ul染色质样品中。4、每一个IP加60ulProtieinGAgarose。·ProtieinGAgarose是一个50%混悬液，吸取前轻轻的颠倒混匀。5、4℃旋转孵育1h。6、瞬离颗粒琼脂糖3000~5000g1min。·不要高速离心7、取出10ul（1%）上清液作为“Input”并放在4℃直到步骤D-1。8、收集剩余的上清液，分装到1ml的微型管中，倒掉颗粒。9、加入免疫沉淀抗体·阳性对照anti-RNAPolymerase，加1.0μg抗体每管。·阴性对照NormalmouseIgG，1.0μg抗体每管。·用户使用的抗体和对照，每管加1~10μg抗体每管（根据抗体效价进行调整）。10、4℃旋转孵育过夜。11、每个IP加60ulproteinGAgarose4度颠转一小时。12、将ProteinAmagneticbeads瞬离（3000~5000g,1min）沉淀下来并除去上清。13、用1ml下列冷的缓冲液洗脱ProteinAbead-antibody/chromatincomplex，每次在旋转台上孵育3~5min，瞬离（3000~5000g,1min）并小心的除去上清。a、LowSaltImmuneComplexWashBuffer(Cat.#20-154),onewashb、HighSaltImmuneComplexWashBuffer(Cat.#20-155),onewashc、LiClImmuneComplexWashBuffer(Cat.#20-156),onewashd、TEBuffer(Cat.#20-157),twowashD、洗脱Protein/DNA复合物实验前准备：·1MNaHCO3放至室温，·打开水浴锅温度调至65℃。（E部分用）1、为所有的IP管和Input管准备最终的的洗脱液。·每管用的洗脱液200ul(10ul20%SDS,20ul1MNaHCO3,170ul无菌水，蒸馏水）。2、准备一个大的收集管，比如，是个收集管混合一起是105ul20%SDS,210ul1MNaHCO3,1.785ml无菌水，蒸馏水。3、Input收集管（C-7）中加入200ulelutionbuffer放至室温直到E部分。4、往所有的收集管中加入100ullutionbuffer，包括antibody/agarose复合物。轻轻混匀。5、室温孵育15min.6、瞬离（3000~5000g,1min）收集琼脂糖,将上清液吸至一个新的收集管中。7、重复4-6步，将洗脱液收集起（总共约200ul）。E、反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。1、所有收集管包活IP和input加入8ul5MNaCl,65度孵育4~5小时或过夜。解交联DNA与蛋白复合物，这一步的样品可放于负20度第二天再用。2、所有的收集管加入1ulRNase37度孵育30min.3、每个收集管中加入4ul0.5MEDTA,8ul1MTris-Hcl,1ulProtocolK，42度孵育1-2小时。F、DNAPurificationUsingSpinColumns1、取出SpinFilter到CollectionTube中。从E一个样本对应一个分离管。2、加1mlBindReagent“A”到每个200μl的DNA样品管中（包括ip和input）并混匀。·5倍体积的BindReagent“A”用于1倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。3、将600ulsample/BindReagent“A”混合液转移到SpinFilter收集管中。4、10000~15000g（~12000rpm）离心30s。5、从离心管中移除SpinFilter保留将CollectionTube，并将离心液除去。·如果第2部形成的沉淀物能够在底部看到，但不影响实验。6、将SpinFilter放回CollectionTube。7、将剩余的600ulsample/BindReagent“A”(从第二步来)吸到SpinFilter中并重复4-6。8、加500ulWashReagent“B”,到收集管的SpinFilter。9、10000~15000g（~12000rpm）离心30s。10、从离心管中移除SpinFilter保留将CollectionTube，并将离心液除去。11、把空的SpinFilter放回sameCollectionTube中。12、10000~15000g（~12000rpm）离心30s。13、除去CollectionTube中的液体。14、将SpinFilter放到一个干净clean的CollectionTube中。15、将50ulElutionBuffer“C”加到SpinFilte的膜中心上。16、10000~15000g（~12000rpm）离心30s。17、除去SpinFilte，洗脱液就是纯化的DNA，可以用于检测或存于-20℃。