PCR引物设计及PrimerPremier50使用介绍精选

PCR引物设计及相关软件使用1主要内容?PCR介绍?引物设计原理?引物设计的优化原则?PrimerPremier5.0介绍?举例说明引物的设计2PCR介绍1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率（定量，对照）3引物设计原理引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。45引物设计的原则1、引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40kb的产物。6引物设计的原则2、引物GC含量GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。7引物设计的原则3、引物Tm引物所对应模板序列的Tm值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)8引物设计的原则4、引物3'端?引物3'末端和模板的碱基完全配对?防止一对引物内的同源性?考虑末端5个碱基的ΔG?引物3′端要避开密码子的第3位9引物设计的原则5、引物序列与模板序列组成的相似性可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。10引物设计的原则6、最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。11引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。12引物设计的原则8、碱基要随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。13引物设计的原则9、引物应具有特异性引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。14引物设计的原则10、ΔG值ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5'端和中间ΔG值较高，而3'端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。15引物设计的原则11、引物的5′端引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。16引物设计的原则12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物17PrimerPremier5.0简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析18PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence19基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction20引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer21引物搜索选项设定引物类型搜索模式5'引物位置范围3'引物位置范围产物大小范围引物长度22搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物23引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer24一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…25引物编辑26引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow27任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1举例说明28SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP29SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP30121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaaNR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框31ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)32引物要求?PCR扩增GFP?GFP两边添加BamHI酶切位点?保证NR1的阅读框不改变335'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3'3'TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5'GFP序列5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3'3'TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5'Primer1:5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5'Primer2Primer1:5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5'TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5'CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：扩增GFP基本序列变性,引物复性34第二步：GC比值；Tm值Primer1:5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5'CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5'CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）35第三步：酶切位点Primer1:5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5'CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5'ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5'ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC36第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct…..Primer1:5'ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1:5'ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA37atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctNR1序列：5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG