细菌培养基本技术

实验原理根据某种细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有适宜的pH。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养。配制好的培养基必须经过灭菌。灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子。对不同的材料，应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸汽灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压蒸汽灭菌锅内，通过加热使锅内的水沸腾并产生水蒸汽。当水蒸汽将锅内的冷空气排尽以后，关闭排气阀并继续加热，这时锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。接种环是用火焰烧灼灭菌的。将某种细菌接种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现出一定的形态特征。目的要求1．通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法。2．了解灭菌的基本原理，以及实验室中常用的灭菌方法。3．初步学会细菌培养的基本技术。材料用具芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂。天平、角匙、200mL烧杯、试管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、精密pH试纸(或pH计)、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱。NaCl、1mol/L的NaOH溶液、体积分数为75％的酒精溶液、蒸馏水。方法步骤一、培养基的配制1．称量用天平称取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2g琼脂。将称好的牛肉膏、蛋白胨和NaCl放入烧杯。2．溶化向上述烧杯中加入蒸馏水100mL，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。3．调pH用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测pH，直到pH为7.4～7.6为止。4．培养基的分装按右图所示，将培养基趁热分装到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的1/5。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。5．加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。例：在叶绿体色素提取和分离与利用牛肉膏蛋白胨培养金黄色葡萄球菌二个实验中，①装色素滤液的试管和②接种培养基的试管均要用到棉塞。下列有关①和②所用棉塞的特点及其作用的说法，正确的是（）A、二者用的都是脱脂棉，可以防止水分吸附B、二者的都不是脱脂棉，有利于水分的吸附C、②所用的棉塞应该比①更紧，以防杂菌污染D、①所用的棉塞应该比②更紧，以防滤液蒸发D6．包扎每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名二、灭菌1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜。高压蒸汽灭菌锅的构造如右下图所示。2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果。3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。4．排出锅内的冷空气。接通电源，当压力上升到49kPa时，打开排气阀放气，当压力降到0时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。5．当锅内的压力上升到98kPa时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min，切断电源。6．当压力降至0以后，打开排气阀，10min以后，旋松紧固螺栓，取出试管。最后，将灭菌锅里的水排放干净。三、搁置斜面当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。四、接种1．用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精(体积分数为75%)棉球擦拭双手。2．当手上的酒精挥发完毕后，点燃酒精灯。注意：一定要等手上的酒精挥发完毕后，再点燃酒精灯，否则，容易将手烧伤。3．接种，操作程序见下图。注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。（1）用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞、不取下。（2）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。（3）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管口一周。（4）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。（6）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。（5）火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线，线要画得细些。例：B图是否正确？如不正确纠正方法是不正确。接种管宜放在菌种管上面4．熄灭酒精灯。实验后的带菌培养基，如果用的是致病菌，必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后方能倒掉；如果是非致病菌，也要经加热后再倒掉。5．接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者姓名填写在标签上。五、培养将接种后的试管放入恒温箱内，在25℃下培养5～7d，或在37℃下培养24h。结论斜面培养基上的细菌生长状况如何？将观察到的结果和得出的结论填写在实验报告上。讨论1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到98kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染练习：1、培养细菌需要根据某种细菌的________________配制特定的________________.其中______________培养基应用广泛.2、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养成分的液体加入___________,溶化冷却即可.3、调节培养基的pH值,用浓度为1mol/L的_________或____________溶液进行调节.营养需要培养基牛肉膏蛋白胨琼脂HClNaOH4、对培养基进行灭菌就是要利用高温杀死_______________________________.压力要达到_________KPa,维持____________分钟.5、搁置斜面时培养基不能温度_____________否则培养基会变成___________应趁热将试管放置成斜面形,使管内培养基形成的斜面长度不超过试管总长的______________.培养基中的一切微生物9820太低固体1/26、微生物接种时各项操作必须在_________条件下进行.因此必须在___________中操作.接种环境在___________上用灼烧去灭菌,双手用_______%的酒精消毒.7、接种时将灭菌的接种环挑取少许________,迅速插入培养基试管里,在斜面上由_________向________连连续划几道__________线,然后将试管口在火焰上灼烧,塞上_____________.无菌无菌箱酒精灯75菌体里外蛇形细棉塞7、接种后的试管要放入________箱中在______0С下培养___________天,即可见斜面上出现_______________.8、接种后塞上棉塞的作用是_________________.且棉塞要塞进试管的深度为棉塞总长的_______恒温371菌落防止杂菌污染、保证通气良好2/3255----7例1、根据下面“枯草杆菌的培养和观察”的实验步骤，回答问题1、实验前一周，取少许新鲜的干稻草切成碎段，放入锥形瓶中，加水（水：草=10：1）并煮沸30分钟后，即用棉塞塞住瓶口，放在不见光的温暖处，或恒温箱中。3---5天后，观察到液体混浊，表面出现一层白色薄膜。2、用玻璃棒挑少量薄膜，涂在载玻片上，盖上盖玻片，在高倍镜下可以观察到许多不活动的枯草杆菌群体。枯草杆菌的芽孢可耐高温而不致被杀死，而在煮沸的情况下其它菌类会因高温使蛋白质变性而死亡。问：在煮沸的新鲜干稻草液中为什么会出现枯草杆菌？例2、以下是关于食品的腐败和食品的保存的实验步骤；1、取标有A----F的六只锥形瓶，瓶内各放入30mL肉汤澄清液2、在A瓶中加入3角匙食盐；B瓶中加入15mL食醋；用棉塞塞住瓶口，A、B瓶都放在恒温箱中，温度为30---370C3、C、D、E、F瓶中不加任何物质，都放置于空气中暴露1h，然后用棉塞住它们的瓶口。4、将C瓶放在30---370C恒温箱中，D瓶放在室温下，E瓶放在40C左右的冰箱冷藏室内，F放在-100C的冷冻室内。5、一周后观察，记录实验结果。请你根据生物学原理对六瓶中食品的变化情况作一预测，并简述理由。答：A、B、F、肉汤不会腐败；因A瓶高浓度盐抑制微生物的生长和繁殖；B瓶高浓度的有机酸也能抑制微生物的生长和繁殖；F低温抑制了微生物的生长和繁殖；E肉汤在短时间内基本不会变质；但可能有少许低温型微生物能生长繁殖；C、D两瓶肉汤都会腐败；因有适合微生物生长繁殖的温度、营养物质等条件。例3：在锥形瓶中装入一定量液体培养基，接入N0个乳酸菌之后密封，放在250C温箱中连续培养若干小时，其间每30分钟测定一次菌数，测得数量变化曲线如图。请分析回答。总细菌数/个N0活细菌数/个培养时间/小时012345678（1）乳酸菌以__________方式生殖,这代表__________类生物普遍具有的生殖方式.分裂生殖原核(2)用N表示总菌数,N0表示初始菌数,t表示增殖世代数,乳酸菌数量增长的数字表达式为N=N02t.当在理想条件下,乳酸菌每30分钟繁殖一代,按上式算,当N0=1000时,连续培养5h,总菌数__________个.1024000t=10N=1000×210(3)在实际培养条件下,乳酸菌增长速度与理想条件下乳酸菌增长速度不同,如果5h后活菌数的变化趋势用曲线表示出来.造成菌群密度变化的外界因素是什么?总细菌数/个N0营养物质减少.代谢产物大量积累.pH发生改变。(4)培养基中不断产生的乳酸来自乳酸菌的_________作用.(5)实验过程中,为什么要在250C条件下进行?无氧呼吸250C时酶的催化效率最高.肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。按肿瘤的形态可分为结节型、巨块型和弥漫型。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。中国是乙肝大国，我国的肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙肝病人也在逐渐增加，乙肝后也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。[1]发病原因总的来说，原发性肝癌的病因至今未能完全阐明，但已证明与以下因素密切相关：1、病毒性肝炎：流行病学统计表明，乙肝流行的地区也是肝癌的高发地区，患过乙肝的人比没有患过乙肝的人患肝癌的机会要高10倍之多。长期的临床观察中发现，肝炎、肝硬化、肝癌是不断迁移演变的三部曲。近来研究表明，与肝癌有关的病毒性肝炎主要包括乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（BCV），而其中又以乙型肝炎最为常见。2、酒精：俗话说“饮酒伤肝”，饮酒并不是肝癌的直接病因，但它的作用类似于催化剂，能够促进肝癌的发生和进展。有长期酗酒嗜好者容易诱发肝癌。这是因为酒精进入人体后，主要在肝脏进行分解代谢，酒精对肝细胞的毒性使肝细胞对脂肪酸的分解和代谢发生障碍，引起肝内脂肪沉积而造成脂肪肝。饮酒越多，脂肪肝也就越严重