微生物的生长及控制

单个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长个体生长个体繁殖群体群体生长=个体生长+个体繁殖数量量第一节测定生长繁殖的方法一、测生长量二、计繁殖数1、直接法测体积法(粗放)称干重法(精确)2、，间接法比浊法：分光光度法(OD)生理指标法：测含氮量1、直接法：用血球计数板在显微镜下进行计数二、计繁殖数2、间接法：用平板菌落进行的活菌计数菌数/mL=cfuX稀释度X10第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长三、微生物的连续培养方法二、微生物的典型生长曲线获得微生物纯培养的方法概念：从一个细胞得到的后代称为纯培养。方法：稀释倒平板法；划线法。一、微生物的个体生长和同步生长同步培养（synchronousculture）：即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂同期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。同步生长通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态；生长曲线的制作：接种适温培养定时取样测定生长量二、单细胞微生物的典型生长曲线(growthcurve)将少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气（厌氧菌除外）等条件下，它们的群体会有规律地生长起来。每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，可以画出一条有规律的曲线即单细胞微生物的典型生长曲线。生长曲线代表了单细胞微生物在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。培养时间(h)I延滞期II指数期III稳定期IV衰亡期0生长速度总菌数活菌数IIIIIIIVlg细胞数(个/ml)微生物的典型生长曲线(growthcurve)Ⅰ延滞期(lagphase)⑤对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。指少量微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。①生长速率常数R等于零。②细胞形态变大或增长。③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。④合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。影响延滞期长短的因素（1）接种龄（2）接种量（3）培养基成分Ⅰ延滞期(lagphase)出现延滞期的原因？把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为0，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程。延滞期出现原因缩短延滞期的意义和方法接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄加大接种量用与培养菌种相同组成分的培养基Ⅱ指数期(exponentialphase)是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。①生长速率常数R最大，代时G最短；②整个群体的生理特性较一致；④酶系活跃，代谢旺盛。③细胞各成分平衡增长，生长速率恒定；三个重要参数（1）繁殖代数(n)（2）生长速率常数(R)（3）代时(G)Ⅱ指数期(exponentialphase)G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)X2=X1·2n两边取对数：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)Ⅱ指数期(exponentialphase)x2x1t1t2影响代时长短的因素（1）菌种（2）营养成分（3）营养物浓度（4）培养温度细胞数或菌体量时间8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响Ⅱ指数期(exponentialphase)指数期的实践意义指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。（1）用作代谢、生理等研究的良好材料；（2）是增殖噬菌体的最适宿主；（3）是发酵工业中用种子的最佳材料。（4）进行染色、形态观察等的良好材料。Ⅲ稳定期(stationaryphase)又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时的生长速度又逐渐趋向零。出现原因营养的消耗营养物比例失调有害代谢产物积累PH值等理化条件不适Ⅲ稳定期(stationaryphase)①生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；②菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数Y表示；Y=(X-X0)/C0-C=(X-X0)/C0X：稳定期的细胞干重(g/ml培养液）X0：刚接种时的细胞干重C0：限制性营养物的最初浓度(g/ml)C：稳定时期限制性营养物的浓度③菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。④细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；⑤通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。③通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；①对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸)等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：②是对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；稳定期的实践意义细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活细菌的数目急剧下降，出现“负生长”，此阶段叫衰亡期，又称死亡期。IV衰亡期(deathphase)IV衰亡期(deathphase)1、特点：（1）细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”（R＜0）；（2）细胞出现多形态，畸形或衰退形；（3）因菌体本身产生的水解酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等。（4）有的微生物进一步合成或释放次生代谢物。（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢等。影响衰亡期的因素及实践意义•与菌种的遗传特性有关:有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡,有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；•与是否产芽孢有关：产芽孢的细菌更易于幸存下来；•与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。单细胞微生物生长的四个时期生长特点成因菌体特征应用及其它延滞期对数期稳定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌数最大,代谢产物大量积累死亡超过繁殖适应新环境条件适宜生存条件开始恶化生存条件极度恶化代谢活跃,体积增长较快个体形态和生理特性稳定有些种类出现芽孢出现畸变与菌种和培养条件有关生产用菌种科研材料改善和控制条件,延长稳定期细胞裂解释放产物三、微生物的连续培养方法分批培养：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。分批培养与连续培养的比较是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。1.恒浊器(turbidostat)特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。2、恒化器(chemostat)是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置；主要获得不同生长速率的菌体；特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。装置恒浊器恒化器控制对象菌体密度(内控制)培养基流速(外控制)培养基无限制生长因子有限制生长因子培养基流速不恒定恒定生长速率最高速率低于最高速率产物大量菌体或与菌体相平行的代谢产物不同生长速率的菌体应用范围生产为主实验室为主恒浊器与恒化器的比较连续培养的优缺点优点高效自控产品质量稳定节约动力、人力、水和蒸汽等缺点菌种容易退化容易污染杂菌营养物的利用率低于单批培养连续发酵将连续培养用于发酵，即为连续发酵，相对于单批发酵而言。SCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。优点：高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月~1年。第三节影响微生物生长的主要因素一、温度二、氧气三、pH值一、温度对微生物生长的影响温度对微生物的影响具体表现在直接影响细胞内的各种生化反应：影响酶活性：温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性：温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输。影响物质的溶解度，对生长有影响。温度是影响微生物生长的一个重要因子。每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度。最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30℃培养提高了14.7%。分段控制方式：0~5小时，30℃；5~40小时，25℃；40~125小时，20℃；125~165小时，25℃。微生物的三种类型(温度）二、氧气对微生物生长的影响根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌（必须有氧存在）好氧菌微好氧菌（有氧无氧均可，但有氧更好）兼性好氧菌（只在较低的氧分压下生长）耐氧厌氧菌（不需氧，但有氧也能生存，氧无毒害）厌氧菌(专性)厌氧菌（氧有毒害，甚至致死）专性好氧菌：必须在有分子氧的条件下才能生长；细胞含有超氧物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。绝大多数真菌、多数细菌和放线菌。兼性好氧菌：在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好；细胞含有SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和不少细菌。微好氧菌：只能较低的氧分压下才能正常生长，。霍乱弧菌、发酵单胞菌属、弯曲菌属等。耐氧菌：生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。乳酸菌多为耐氧菌。厌氧菌：分子氧对它有毒害。生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）好氧菌兼性好氧菌厌氧菌耐氧菌微好氧菌在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施:培养好氧微生物：需振荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时在培养基中添加还原剂，降低培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。各类菌所含对氧解毒酶专性好氧菌SOD，过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD，过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD，过氧化物酶厌氧菌体内无SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用。厌氧菌的氧毒害机制——SOD学说：生物体中超氧阴离子的形成与去除O2+eO2-·超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧物阴离子歧化酶（SOD）是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。H2O+1/2O22H2O2·O2-+2H+H2O2+O2SOD一切好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶一切好氧生物NADH2NAD过氧化物酶耐氧菌三、pH值对微生物生长影响（一）环境pH值对微生物生长的影响影响