微生物学实验技术指导书

实验须知普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。微生物学实验室常用器皿微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌后用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿一般要求硬质玻璃，才不受高温和短暂的烧灼而不至破裂；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当，也会影响实验的结果。目前国外微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。本节将主要对玻璃器皿做详细介绍，同时也对接种或转移微生物工具做相应的说明。一、器皿的种类、要求与应用1.试管（testtube）微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这要在塞棉花塞时管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管造成污染，也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需要使用螺口试管，盖以螺口胶木塞或塑料帽（图Ⅰ-1，B，C）。培养细菌一般用金属（如铝）帽或棉塞（图Ⅰ-1，D，E）。也有的用泡沫塑料塞。试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号：（1）大试管（约18mm×180mm），可盛倒平板用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需大量菌体时用）和盛液体培养基用于微生物的振荡培养；（2）中试管（约13-15mm×100-150mm），盛液体培养基培养细菌或作琼脂斜面用，亦可用于细菌、病毒等的稀释和血清学试验；（3）小试管（10-12mm×100mm），一般用于糖发酵或血清学试验，和其他需要节省材料的试验。2.德汉氏小管（Durhamtube）观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6mm×36mm），（图Ⅰ-2，A）。此小套管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。3.小塑料离心管，又称Eppendorf管（图Ⅰ-2，B）。有1.5ml和0.5ml两种型号，主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心、DNA（或RNA）分子的检测、提取等。4.吸管（pipette）（1）玻璃吸管（glasspipette）和吸气器（aspirator）①玻璃吸管微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管。这种吸管一般有两种类型，一种是称之为血清学吸管（serologicalpipette），这种吸管刻度指示的容量包括管尖的液体体积，使要将所吸液体吹尽（图Ⅰ-3，A）；另一种类型称之为测量吸管（measuringpipette），这种吸管刻度指示的容量不包括管尖的液体体积，使用时不能将所吸液体吹尽，而是到达所设计的刻度为止（图Ⅰ-3，B）。除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，C）来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。②吸气器在使用刻度玻璃吸管时，一般可采用几种不同的吸气器。图Ⅰ-4中的三种类型目前都有市售。使用时，将吸管插入吸气器下端，通过旋动转盘键（图Ⅰ-4，A中的a），或按图Ⅰ-4，B中的不同部分（b、c、s），或按图Ⅰ-4，C中的d、e键来吸取或释放液体。如果嘴吸，则一定要在吸管上端塞有棉花。用刻度吸量管取液体的体积时，以液体的凹面为准（图Ⅰ-3，D）。（2）微量吸管（micropipette）又称微量加样器，主要用来吸取微量液体，规格型号很多，图Ⅰ-5表示其中的一种型号。每个微量吸管在一定范围内可调节几个体积，并都标有使用范围，例如：0.5～10μl、2～10μl、10～100μl、100～1000μl等。使用时：①将合适大小的塑料嘴（tip）牢固地套在微量吸管的下端；②旋动调节键（图Ⅰ-5，A），使数字显示器上（图Ⅰ-5，B）显示出所需要吸取的体积；③用大拇指按下调节键（图Ⅰ-5，C），并将吸嘴插入液体中；④缓慢放松调节键，使液体进入吸嘴，并将其移至接收试管中；⑤按下调节键，使液体进入接收管；⑥按下排出键，以去掉用过的空吸嘴或直接用手取下吸嘴。除了可调的微量吸管外，也有不可调的，即一个吸管只固定一种体积。因应用范围受到限制，所以一般用得较少。5.培养皿（petridish）常用的培养皿（图Ⅰ-6），皿底直径90mm，高15mm，皿底皿盖均为玻璃制成，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养皿表面干燥。例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种，活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。6.三角烧瓶（erlenmeyerflask）与烧杯（beaker）三角烧瓶有100、250、500和1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50、100、250、500和1000ml等，用来配置培养基与各种溶液等。7.注射器（injector）一般有1、2、5、10、20、25ml不同容量的注射器。注射抗原于动物体内，可根据需要使用1、2、5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。微量注射器有10、20、50、100μl等不同的型号。一般在免疫学或纸层析、电泳等实验中滴加微量样品时应用。8.载玻片（slide）与盖玻片（coverslip）普通载玻片大小为75mm×25mm，用于微生物涂片、染色、做形态观察等。盖玻片为15mm×18mm。凹玻片是在一块较厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-7），做悬滴观察活细菌以及微室培养用。9.双层瓶（doublebottle）由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-8），内层小锥形瓶放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，以瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。10.滴瓶（dropperbottle）用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-9）。11.接种工具接种工具有接种环（inoculatingloop）、接种针（inoculatingneedle）、接种钩（inoculatinghook）、接种铲（inoculatingshovel）、玻璃涂布器（glassspeader）等（图Ⅰ-10）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍死直径以0.5mm为适当，环的内径为约2-4mm，环面应平整。图Ⅰ-11表示一个简易地制作接种环的方法。接种某些不易与培养基分离的放线菌和真菌有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要粗一些约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻璃棒弯曲（图Ⅰ-12）或将玻璃棒一端烧红后压扁而成。二、玻璃器皿的清洗方法清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和玷污程度等的不同而有所不同。现分述如下：1.新玻璃器皿的洗涤方法新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液（见附录Ⅶ）。浸泡后用自来水冲洗干净。2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至十次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱内烘干。玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液（来苏水）或0.25%新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸0.5小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。盛放一般培养基用的器皿经上述方法洗涤后，即可使用，若需精确配置化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。（2）玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（量筒或标本瓶底应垫有脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损），免得干燥后难以冲洗干净，待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室，可用冲出棉花的方法多冲洗片刻，必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2%煤酚皂溶液，或0.25%新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。（3）载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分钟，用软布或脱脂棉花擦拭，立即用自来水冲洗，然后再稀洗涤液中浸泡0.5-2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用。使用时在火焰上烧去乙醇。用此法洗涤和保存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有水珠。检查过活菌的载玻片与盖玻片应先在2%煤酚皂溶液或0.25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h，然后按上述洗涤与保存。三、空玻璃器皿的包装1.培养皿的包装培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5-8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行干热或湿热灭菌。如将培养皿放入金属（不锈钢）筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒型的带盖外筒，里面放一装培养皿的框架（图Ⅰ-13），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。2.吸管的包装准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当（过紧吹吸液体太费力