中药化学实验技术

中药化学实验技术硕士研究生课程中药整体成分有效组分有效成分有效部位检识提取颜色反应色谱检识研究目标实验技术药效物质基础分离一级代谢产物与二级代谢产物大分子与小分子有机物与无机物亲水性与亲脂性一、中药中各类成分第一节中药成分与定性鉴别大分子小分子多糖、低聚糖蛋白质、酶鞣质苷类橡胶油脂和蜡氨基酸无机盐单糖挥发油苷元生物碱色素有机酸亲水性亲脂性1、单糖、低聚糖、多糖淀粉、粘液质、果胶、树胶、甲壳质等鉴别淀粉：加碘呈蓝色（紫红色）还原糖：斐林试剂、吐伦试剂非还原糖：Molisch反应TLC、PC：展开剂——BAW系统显色剂——苯胺-邻苯二甲酸去除醇沉法二、定性鉴别2、氨基酸、蛋白质、酶去除：水煮变性沉淀法、乙醇变性沉淀。鉴别：加热沉淀试验：加热煮沸→混浊或沉淀+5%H2SO4（不加热）→混浊或沉淀双缩脲反应：+40%NaOH，1%CuSO4→紫红色（蛋白质）（多肽、蛋白质）3、油脂高级脂肪酸的甘油三酯鉴别油斑检查：油斑挥发→挥发油；油斑不消失→油脂或类脂磷钼酸反应：喷洒5%磷钼酸试液→蓝色（油脂、三萜、甾醇）去除醇提水沉,Pet萃取/脱脂4、树脂树体受伤后从树胶道内分泌渗出的一种液体，暴露在空气中，逐渐变成一种半透明的固体或者半固体物质。混合物：与挥发油或者树胶、有机酸等成分混合存在。分为三类：树脂酸类、树脂醇类、树脂烃类。性质：非结晶性固体，不溶于水，能溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂。去除醇提水沉,Pet萃取/脱脂.1'1OCOOOHHOHOHOHOHOHOOHHOOHOHOCOCOOH2COCOOOOHOOCOOH2CCOOOHHOOHOHOOHOHOHCOOHOHOHOHOHOC5、鞣质鉴别FeCl3试剂：蓝、暗绿或蓝紫色三氯化铁-铁氰化钾试剂：喷洒→蓝色斑点香草醛-盐酸试剂：喷洒→红色（间苯二酚、间苯三酚）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠→红色TLC：吸附剂——硅胶G或纤维素展开剂——n-BuOH：HAc：H2O；15%HAc显色剂——1%FeCl3试液1%三氯化铁-1%铁氰化钾试液→蓝、绿或黑色鞣质与酚类的区别：+明胶沉淀分离（去除）明胶沉淀法：水提液中加4%明胶水溶液，过滤；浓缩，加3-5倍量乙醇，去明胶；聚酰胺法：柱中不被醇洗脱的部分醋酸铅沉淀法：生物碱沉淀法：加1.5%咖啡因，CHCl3回收咖啡因；氨水沉淀法：醇提液中调PH8石灰乳法：水提液浓缩液+20%石灰乳（pH12）。6、色素种类：叶绿素、叶黄素、胡萝卜素（亲脂性）花色苷类、黄酮苷、醌苷（亲水性）除去叶绿素：醇提液：浓缩加水；水提液：pet萃取吸附脱色法：活性炭、氧化铝、碳酸钙。7、有机酸种类：游离型：脂肪酸、酚酸结合型：金属盐、生物碱盐、脂肪、蜡、酯、苷等；分离亲水性酸：石灰乳或醋酸铅沉淀除去，阴离子交换树脂；亲脂性酸：碱溶酸沉；鉴别溴酚兰试液：喷洒→蓝色背景黄色斑点三、中药成分的系统预试石油醚、95%乙醇、5%HCl-乙醇、水水提取液中药材粉末5g，用10倍量水在50～60℃水浴上加热1小时，滤液用于糖、多糖、有机酸、皂苷、酚类、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱等。乙醇提取液中药材粉末5g，用10倍量95%乙醇水浴回流加热1小时，滤液用于酚类、鞣质、有机酸、香豆素、强心苷、黄酮、蒽醌、甾体等预试验。5%HCl-乙醇提取液中药材粉末5g，用10倍量5%HCl-乙醇水浴回流加热0.5小时，滤液用于生物碱预试验。一、溶剂分类第二节溶剂与化合物溶解性亲脂性有机溶剂（强亲脂性、中等亲脂性）2.34.475.26.1石油醚苯乙醚＃氯仿乙酸乙酯petC6H6Et2OCHCl3EtOAc亲水性有机溶剂水21.526.031.281丁醇＃丙酮乙醇甲醇水BuOHMe2COEtOHMeOHH2O水价廉，无毒，易进植物细胞；专属性差，难浓缩，不易保存。亲水性有机溶剂较价廉，毒性较小，易进入植物细胞；专属性差。亲脂性有机溶剂（多用于分离纯化）专属性强，挥发性大，易回收；易燃，毒性较大，价贵，设备要求高，难进入细胞。二、溶剂特性紫杉醇从红豆杉科红豆杉属植物枝叶中分离乙酸乙酯、乙醚、乙腈、丙酮、甲醇、己烷、异丙醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-二氯甲烷、乙酸乙酯-丙酮、乙酸乙酯-乙醚(1∶1)等溶剂浸膏重干浸膏植物次数MeOH20.98%0.0270.0058多次EtOAc-Me2CO7.70%0.0840.00651次(1∶1)紫杉醇量%提取效果比较：极性基团大小及在分子中的比例—CH3—CH2——CH=CH=—O—R—S—R—NO2—N（R）2—OCOR—CHO—COR—NH2—OH—COOH—SO3H结构对称性H2O---CO2结构的平面性黄酮与二氢黄酮三、化合物结构与极性-NHNOHHCOOMeNNOCOMeHRMeOCOOMeOHR=-CH3R=-CHO长春碱?醛基长春碱?COHCOOCH3OHOCOHCOOCH3OHO三尖杉酯碱高三尖杉酯碱R=R=NOOROOMeHH物理溶解：相似相溶溶质与溶剂的分子之间依靠静电引力而溶解性质、结构相似性物理-化学溶解：形成氢键,螯形结构，缔合作用等化学溶解：酸性、碱性成分四、化合物结构与溶解性极性溶剂：离子化合物、能离解的共价化合物非极性溶剂：非极性共价化合物水EtOH有机溶剂蛋白质、多糖单糖、氨基酸季铵型生物碱、鞣质、苷类苷元、游离生物碱++--++--+Pet：油脂、叶绿素、挥发油、游离甾体及萜类；CHCl3/EtOAc：游离生物碱、有机酸、黄酮等苷元EtOH/MeOH：苷类、生物碱或有机酸盐、鞣质；H2O：糖、氨基酸、蛋白质、无机盐等。第三节提取方法一、提取过程溶剂接触、渗透、浸润、溶胀扩散、主动渗透成分提取平衡（内外浓度相同）二、影响提取因素药材粉碎度：粉碎细，提取效率越高。温度：温度越高，溶解度越大，扩散速度加快浓度差：搅拌、换溶剂、渗漉。时间：不是越长越好。药材新鲜程度：新鲜药材，有机溶剂提取率低；油脂类药材，先脱脂。三、常用提取方法溶剂提取法浸渍法渗漉法煎煮法回流提取法连续回流提取法水蒸汽蒸馏法升华法（一）超临界流体萃取SupercriticalFluidExtraction，SFE80年代引入，流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。四、提取新技术例：萃取甘草中甘草次酸SFE-CO2：13倍连续回流提取率密度接近液体－－萃取能力强粘度接近气体－－传质性能好改变极性，后续须分离优点：溶剂用量小、周期短、提取率高、不回收溶剂方法：1995年应用药物：先将以酸水提取，继以碱水提取；提取水最佳pH：有效成分、药理作用为指标。原理中药成分：酸性成分、碱性成分、中性成分；消化道：胃中(酸性)、小肠(pH4~7)；十二指肠(pH4~5)、大肠(pH7~8)（二）半仿生提取法Semi-bionicExtractionmethod，SBE法水pH芍药苷mg/ml甘草次酸mg/ml芍药苷+甘草次酸mg/ml20.825.155.9481.444.395.75水煎煮1.094.855.9仿生0.926.27.1芍甘止痛颗粒剂SBE法WE法（水提）SBAE法WAE法（水提醇沉）利用微波(300~300000MHz电磁波)能来提高提取效率的一种技术，90年代国外应用。原理：（三）微波辅助提取法Microwaveextraction水极性溶剂药物微波成分吸收、加热细胞壁破裂扩散阻力减小特点①对萃取物具有较高的选择性，目标组分得率高;②溶剂消耗量少，提取效率高;③有利于热不稳定物质的提取;豆类中化合物：提取效率优于索氏提取法应用90年代，加拿大、美国等国家重视利用微波辅助提取技术提取有应用价值的医药组分,目前应用于多糖类、黄酮类、蒽醌类、有机酸类、生物碱类等中药有效成分的提取研究中。微波法回流提取法175W，5min70℃，1h银杏黄酮80%乙醇提提取物黄酮含量高18.8%（四）超声波提取TheUltrasonicwithdrawsthetechnique机械振动由振荡信号转换，传播到介质热效应超声能转化为热能空化效应高温高压破坏细胞壁原理2×104～1×107Hz超声波颠茄草中莨菪碱，得率相同：超声波技术：20min传统渗漉法：10h脱脂豆粕大豆异黄酮：超声波技术：20kHz，30min，得率0.452加热回流法：120min，得率0.310特点：速度快，效率高金针菇子实体多糖：超声波提取：提取率提高76.22%微波提取：提取率提高83.67%存在问题处于实验室阶段；对超声作用原理、动力学关系、药物结构与超声作用的关系研究不深入。与更多先进的方法联用，各种方法优势互补。（五）酶工程技术葛根总黄酮：加0.5%纤维酶提取，总黄酮高13%；红豆杉中紫杉醇：加纤维素酶，提取率高3.01倍cellulaseengineeringtechnique酶破坏细胞壁存在问题价较高；与先进方法联用，才能发挥其最大优势。如何与加热回流等方法衔接，配套使用？溶解度差异在两相溶剂中分配比差异吸附性差异分子大小差异解离程度差异第四节分离纯化方法CCD(逆流分配法)DCCC(液滴逆流色谱)HSCCC(高速逆流色谱)重结晶沉淀法溶剂沉淀法酸碱沉淀法专属沉淀试剂盐析法分配比k萃取法调pH萃取大小1.重结晶一.根据成分溶解度的差异有效成分大小大大小小杂质溶剂：热冷两种溶剂互溶;第一种溶剂(I)对成分的溶解度大，沸点低;第二种溶剂(II)对成分的溶解度小。温度:多数较低时间:较长浓度:较稀溶液放置,再适当挥发至一定浓度和粘度,析出结晶.热时澄清、冷时变混操作在I溶剂中溶解加II溶剂至浑浊加热或加I溶剂至溶放置析晶促进结晶生成1）挥去适当溶剂；2）玻棒磨擦瓶壁；3）加入晶种。常用混合溶剂:常用洗脱剂H2O-EtOH;H2O-Me2CO;EtOH-Et2O;CHCl3-MeOH;CHCl3-Et2O;pet-Me2CO;pet-Et2O2.沉淀法溶剂沉淀法酸碱沉淀法专属沉淀试剂其它水提醇沉醇提水沉Me2CO-Et2O沉淀碱溶酸沉酸溶碱沉生物碱沉淀试剂铅盐沉淀试剂明胶沉淀试剂胆甾醇石灰乳盐析1、分离因子β50两相溶剂萃取法系统溶剂法pH梯度萃取法酸、碱及两性化合物形成络合物硼酸,吉拉德试剂,邻苯二甲酸酐等二.根据成分在两相溶剂中分配比的差异成分极性成分的类型适用溶剂强亲脂性（极性小）挥发油、脂溶性色素、甾醇类、苷元石油醚、己烷亲脂性苷元、生物碱、树脂、醛、酮、醇、醌、有机酸、某些苷类乙醚、三氯甲烷中等极性小中大某些苷类（如强心苷等）某些苷类（如黄酮苷等）某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）三氯甲烷：乙醇乙酸乙酯正丁醇亲水性极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些生物碱盐丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、黏液质、果胶、糖类、氨基酸、无机盐类水易乳化抽滤热敷乳化层分出，用新溶剂萃取。缺点方法瓷片2.分离因子β50CCD(逆流分溶法)DCCC(液滴逆流色谱)内径约1.6mmHSCCC(高速逆流色谱法)两相溶剂反复剧烈混合和分层分配频率13次/秒溶剂系统是分离的关键：弱极性正己烷+水MeOH/EtOH/EtOAc亲脂性化合物中等极性氯仿+水MeOH/EtOH/EtOAc苷元、苷强极性正丁醇+水MeOH/EtOH/EtOAc亲水性化合物调pH溶剂体系基本两相调节剂适用化合物三氟乙酸Al2O3硅胶吸附层析聚酰胺大孔树脂活性碳离子交换层析凝胶层析液－液层析（分配柱层析）液相层析液－固层析色谱法分类硅胶(SiO2·XH2O)柱层析:100-160目1、硅胶/氧化铝水分17%,无吸附作用,105℃可除水，重现活性。三.根据成分的吸附性差异Al2O3100~150目——柱层析用分类:碱性氧化铝（pH9）:生物碱,甾族成分中性氧化铝（pH7.5）:中性、碱性亲脂性成分酸性氧化铝（pH2~3)：有机酸类成分活度：含水量（%）0361015活度（级）IIIIIII