酶活性中心

酶的活性中心(一)酶活性中心的概念实验证明，酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的一定区域。某些酶蛋白分子经微弱水解切去相当一部分肽链后，其残余的部分仍保留一定的活力，似乎除去的那部分肽链是与活力关系不大的次要结构。最初，把酶分子中与底物接触的或非常接近底物的部分称为酶的活性部位，而直接与酶催化有关的部位称为活性中心，这种活性中心概念不够严格，它只能说明：在一个很大的完整的酶蛋白分子中只有很小一部分是与底物结合的，并与催化作用直接有关。后来，大量的工作，特别是近十余年来，因X──射线衍射法的发展，再结合化学方法所得到的结果，使人们进一步明确了活性中心的概念：对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子，或辅酶分子上的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。一般还认为活性中心有两个功能部位：第一个是结合部位，一定的底物靠此部位结合到酶分子上，第二个是催化部位，底物的键在此处被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。活性中心的形成要求酶蛋白分子具有一定的空间构象，因此，酶分子中的其他部位的作用对于酶的催化来说，可能是次要的，但绝不是毫无意义的，它们至少为酶活性中心的形成提供了结构基础。所以酶的活性中心与酶蛋白的空间构象的完整性之间，是辩证统一的关系。当外界物理化学因素破坏了酶的结构时，首先就可能影响酶活性中心的特定结构，结果就必然影响酶活力。(二)用于判断和确定酶活性中心的主要方法1．酶的专一性研究通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断和确定活性中心的结构特点，来判断和确定活性中心的结构。另外，研究酶的竞争性抑制剂的必需结构以及酶与专一性底物的相近关系也有助于了解酶活性中心的结构。2．酶分子侧链基团的化学修饰法(chemicalmodification)寻找酶活性中心的另一个有效办法是使用一些对酶分子侧链功能基团可进行共价修饰的试剂作用于酶，以查出哪些基团是保持酶活力所必需的。当这种试剂与酶分子侧链上的功能基结合后，如果酶并不失活，则表明含有这个基团的氨基酸残基与酶的活性中心无关；如果酶全部失活，则表明它属于活性中心；如果酶部分地失去活力，则这个氨基酸残基可能属于活性部位，但可能只是其底物结合部位，并不是其催化部位。酶分子中可以被化学修饰的基团很多，如硫氢基、羟基、咪唑基、氨基及羧基等。可以用作化学修饰的试剂也很多，目前已有七十多种，但是十分理想的并不多。用得较多的有DFP(DIFP)及TPCK。DFP这个毒性很大的试剂是有机磷抑制剂中较重要的一个。实验时先把DFP(DIFP)加到酶中，再对磷酸化了的酶进行水解，然后对水解产生的肽段进行分离和鉴定，可以得到含有磷酰化丝氨酸残基的肽段，即DIP标记了的肽段，称为DIP-肽。DIP在水解中不被除去，这对于阐明酶活性中心的组成是很重要的。最后，进一步再对这种DIP-肽段进行序列分析，可以得出一些酶活性中心的氨基酸顺序。表4-10中列举了一部分用DFP标记的酶的DIP-肽段的氨基酸顺序，从表中可以看出许多酶活性中心都有丝氨酸，某些蛋白水解酶活性中心还有共同的天冬-丝-甘顺序。它通过使组氨酸烷化而对酶进行亲和标记。亲和标记是辨认酶活性中心功能基团的另一种重要的方法。人工合成一些与正常底物相似的化合物，使其与酶反应，活性中心中与底物起反应的基团就和TPCK结合，从而找出活性中心中的氨基酸残基。DFP与TPCK两个试剂结合使用，在胰凝乳蛋白酶活性中心的研究中起了很大的作用。此外，碘乙酸、对-氯汞苯甲酸等可以与酶侧链中的巯基起作用，如果酶活力在加入上述试剂之后受到抑制，则表明巯基属于活性中心。采用这类试剂时，还可配合使用抑制剂，例如丙二酸盐(琥珀酸的类似物)抑制琥珀酸脱氢酶，加入它后可以保护酶，使酶免受不可逆的巯基抑制剂──碘乙酸的失活作用，这也表明巯基在某些酶的活性中心占有特殊的地位。表4-11还列举了一些试剂，用它们对酶进行修饰后证明，组氨酸的咪唑基、赖氨酸的ε-氨基常常也都是酶活性中心中的必需基团。此外，还有一些用来寻找酶活性中心的方法，例如用强还原剂硼氢化钠使醛缩酶的酶-底物复合体还原，对这个还原了的酶-底物复合体进行部分水解，可以得到一个含甘油酰衍生物的肽，其中有特异性的赖氨酸残基。3．X-射线晶体衍射法X-射线晶体衍射法对于探明酶的活性中心提供了许多直接和确切的实验结果。目前运用这一方法对几十种蛋白质的空间构象(三维结构)进行了研究，其中大部分为酶。例如许多蛋白水解酶类、脱氢酶类中的许多酶等。实验表明，大多数酶分子的极大部分非极性侧链汇集成三维结构的“骨架”，而大部分极性侧链则位于酶分子表面，这样的结构是有利于进行酶的催化反应的。很有意义的是：酶侧链化学修饰法与X射线晶体衍射法的结果基本上是一致的。此外，酶的反应速度常数的研究，以及pH对米氏常数和最大反应速度关系的研究等酶促动力学方面的工作，对于判断活性中心和阐明酶的作用机理，也有重要的参考价值。