β-葡糖苷酶(纤二糖酶)测定方法

试验二β-葡萄糖苷酶(BG;EC3.2.1.21)活性测定新鲜土样比色法的原理：以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为基质，水解产生对硝基酚，比色测定（硝基酚比色法）。1.配置溶液：（1）改进的通用缓冲溶液（MUB）贮备液：12.1g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3即Tris）、11.6g马来酸（C4H4O4）、14g柠檬酸（C6H8O7）和6.3g硼酸（H3BO3）溶于500ml1mol.L-1NaOH溶液中，用去离子水稀释至1L，于4℃下贮存。（2）pH值6.0的MUB缓冲溶液：在继续搅拌下，在200mlMUB贮备液中分别滴加0.1mol.L-1HcL或0.1mol.L-1NaOH至溶液pH值为6.0，去离子水稀释定容至1L（3）4-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside对硝基酚-β-D-吡喃葡糖苷（PNPG）溶液[C12H15NO8=25mmol.mol-1]：0.377gPNPG溶于40mlMUB溶液（pH为6.0）中，用相同pH值的缓冲液稀释至50ml，于4℃下贮存。301.25（4）Cacl2溶液（0.5mol.L-1）：取无水Cacl255.49g加入1L的容量瓶中配置（5）Tris缓冲液[c（C4H11NO3）=0.1mol.L-1，pH值12.0]：12.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于800ml去离子水，用0.5mol.L-1NaOH调节pH至12.0，去离子水稀释至1L（6）标准对硝基苯酚溶液：溶解0.500g对硝基酚于400ml双去离子水中，定容到500mL，保存于4度，用时再稀释10倍。稀释后为100ug.ml-1。（一般需1000ppm）2.试验过程(1)取1g新鲜土样(2mm)于100ml三角瓶中，加0.25ml甲苯,通风橱10min后，4mlpH为6.0的MUB溶液和1mmPNPG溶液，盖上瓶盖，充分混匀，在37℃培养1h。(2)加1mlCacl2溶液和4ml0.1MpH值12.0的Tris缓冲液，摇匀，迅速用快速滤纸过滤，滤液在400nm处比色测定。做空白对照时，可在培养结束后，加Cacl2溶液和tris缓冲液之前加入1mL缓冲液（代替1mL底物）溶液。每个样品必须做一个空白和三次重复。(3)标准曲线：吸取0，0.5，1，2，3，4，5,6ml于100ml容量瓶中，加去离子水稀释至5ml，然后加1ml氯化钙溶液和4mltris溶液，充分混匀后定容50ml，过滤，400nm处比色测定结果计算β-葡萄糖苷酶活性（µg对-硝基酚.g-1.h-1）=CV/dwt式中：C表示样品对-硝基酚的含量（µg/ml）；V表示土壤溶液体Dwt表示烘干土壤质量个人做法实验终止后加入5mL离子水稀释后过滤（若果用微孔板，则可以不用加离子水）