紫外-可见分光光度计

1第五节紫外可见分光光度计2（一）光源对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射足够强度的连续辐射，有良好的稳定性和较长的使用寿命。并且辐射强度随波长没有明显变化。分光光度计中常用的光源有白炽光源（热辐射光源）和气体放电光源两类。一、仪器组成光源单色器样品室检测器显示3白炽光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯。钨灯和碘钨灯可使用的范围在320~2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压4次方成正比。光电流与灯丝电压的n次方（n1）成正比。因此，需严格控制灯丝电压，仪器需配有稳压装置。卤钨灯：在钨灯中加入碘或溴蒸气，提高白炽灯的发光强度和使用寿命。4它们可在180~400nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，是紫外光区应用最广泛的一种光源。氘灯的光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大3~5倍。气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。5（二）单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。6单色器一般由入射狭缝、准直器、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。②准直装置：透镜或反射镜，使入射光成为平行光束7③色散元件：棱镜或光栅，将复合光分解成单色光，是单色器的核心部分棱镜有玻璃和石英两种材料。色散原理：不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率，因而将不同波长的光分开。89玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于350~3200nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185~4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。10光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，可用于紫外、可见及红外光域在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点：各级光谱会重叠而产生干扰。11棱镜分光的仪器因色散不均匀，只能以狭缝的实际宽度表示，一般为1~3nm，单色光纯度要经过换算得到；光栅分光的仪器多用单色光的谱带宽度表示狭缝宽度，直接表达单色光的纯度。12④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝131.吸收池的材料一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于紫外光区，大于360nm时，氢的发射线会叠加在连续光谱上，不宜使用。玻璃吸收池只能用于可见光区。（三）吸收池用于盛放分析试样，又称为液池、样品池、比色皿14玻璃360nm2.25mm15石英200nm2.5mm162.吸收池的形状波长范围3.使用注意事项容易破碎可拆卸圆形测量池两面透光圆形测量池两面透光1cm长方形测量池两面透光气体测量池两面透光微量测量池两面透光流动测量池两面透光17为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。波长范围3.使用注意事项容易破碎18（四）检测器检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。19硒光电池对光的敏感范围为300~800nm，其中又以500~600nm最为灵敏。特点：能产生可直接推动微安表或检流计的光电流缺点：容易出现疲劳效应，只能用于低档的分光光度计中。20光电管：紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。光电倍增管：检测微弱光最常用的光电元件特点：灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，对光谱的精细结构有较好的分辨能力。缺点：强光照射会引起不可逆损害，不适用于检测高能量。21（五）信号指示系统作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。22二、仪器类型分光光度计分为单波长和双波长仪器231，单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，进行吸光度测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。此类仪器对光源发光强度稳定性要求高。24单光束紫外-可见分光光度计光路示意25技术指标：波长范围：330－800nm波长准确度：±2nm波长重复性：1.0nm透射比准确度±1.0％透射比重复性：0.5％T光谱带宽：6nmT－A转换准确度：0.004(A)262，双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。特点：测量中不需要移动吸收池，可以在随意改变波长的同时自动记录所测量的吸光度值，描绘吸收曲线。272829UV762技术指标：波长范围：200~1100nm波长准确度：±0.5nm波长重复性：0.2nm透射比准确度：±0.5％T303，双波长分光光度计同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光。利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA（ΔA=A1-A2）。31特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)。克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。缺点：仪器需要装备两个单色器，价格较高，体积较大。用微机装备的单波长仪器能实现上述双波长仪器的功能。3233双波长光度计光路示意图34722W型可见分光光度计UV-3000主要技术指标：波长范围190-1100nm光谱带宽4nm波长准确度±0.5nm波长重复性≤0.3nm光度准确度0.3%T(0-100%T)±0.002A(0-0.5A)±0.004A(0.5-1A)光度重复性≤0.2%T(0-100%T)0.001A(0-0.5A)0.002A(0.5-1A)35三、分析条件选择（一）仪器测量条件测量误差：由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。当相对误差c/c最小时，求得T=0.368或A=0.434即当A=0.434时，吸光度读数误差最小！吸光度测定应控制在0.434左右。通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.15~0.8范围内。36浓度测量的相对误差与透射比的关系37(二)溶剂的选择选择溶剂时注意下列几点：1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质是惰性的，所成溶液具有良好的化学和光化学稳定性。2）在溶解度允许范围内，尽量选择极性较小的溶剂。3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。38（三）显色反应条件选择1.显色剂的选择原则⑴显色反应的灵敏度高显色反应生成物吸收系数大⑵测量结果重现性好显色反应生成物组成恒定、配合物稳定、显色条件易于控制⑶对照性好显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大392.显色剂用量：选择恒定吸光度时的显色剂用量3.溶液酸度：配位数和水解等与pH有关。4.显色时间、温度、放置时间40（四）参比溶液选择1.溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比可消除溶剂、吸收池等因素的影响2.试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）可消除试剂中的组分产生吸收的影响413.试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，采用试样作参比（不能加显色剂）适用于试样中有较多的共存组分，加入的显色剂剂量不大，并且显色剂在测定波长无吸收4.平行操作溶液参比用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样进行同样处理，由此得到平行操作参比溶液。42（四）干扰消除l控制反应条件：配合物稳定性与pH有关；l选择掩蔽剂l合适测量波长l干扰物分离43四、分光光度计的校正在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正。1.波长校正：使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。2.吸光度校正：采用K2CrO4标准液校正（在25℃时，于不同波长处测定0.04000g/L的K2CrO4溶液（0.05mol/L）的吸光度A，调整光度计使其A达到要求的吸光度。