中药化学成分的一般研究方法

第二章中药化学成分的一般研究方法第一节中药化学成分及生物合成中药化学成分主要类型按化学成分的活性可分为：有效成分、无效成分按生物合成途径可分为：一级、二级代谢产物按结构母核可分为：苷类、醌类、苯丙素类、黄酮类、萜类、甾类、生物碱等。糖和苷醌类化合物苯丙素类黄酮类化合物萜类和挥发油三萜甾体生物碱一、有效成分(二)无效成分1.脂溶性1）蜡高级不饱和脂肪酸（16－30碳）和高级一元醇结合的酯。主要在植物茎、叶的表面。常温下为固体。为亲脂性成分。2）脂肪油不饱和脂肪酸（链长短不一）与丙三醇形成的甘油酯。为亲脂性成分。3）叶绿素及胡萝卜素二、中药化学成分主要的生物合成途径1、一次代谢过程糖、蛋白质、脂质、核酸、叶绿素等这些对植物生命活动必不可少的物质则为一次代谢产物(primarymetabolites)。2、二次代谢过程一次代谢产物在特定的条件下，或作为原料或作为前体，又进一步经历不同的代谢过程，生成生物碱、萜类等化合物的过程。二次代谢产物(secondarymetabolites)并非在所有的植物中都能发生。结构富于变化，不少物质具有明显的生理活性。二、中药化学成分的主要生物合成途径（一）乙酸-丙二酸（AA-MA）途径以乙酰辅酶A为起始物质，丙二酸单酰辅酶A起延伸碳链的作用。通过这一途径能生成脂肪酸类、酚类、醌类等化合物。（二）甲戊二羟酸（MVA）途径起始物质为MVA，在ATP作用下进行。萜类、甾类化合物均由这一途径生成。现也被称为桂皮酸途径。具有C6-C3及C6-C1基本结构的化合物由这一途径衍化生成。如苯丙素类、木脂素类、香豆素类等。(三)莽草酸途径(四)氨基酸途径大多数生物碱类成分由此途径生成。有些氨基酸，如鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等，经脱羧成为胺类,再经过一系列化学反应(甲基化、氧化、还原、重排等)生成各种生物碱。(五)复合途径许多二级代谢产物由上述生物合成的复合途径生成。即分子中各个部分由不同的生物合成途径产生。如：查耳酮类、二氢黄酮类化合物：A环：由乙酸-丙二酸途径B环：莽草酸途径生成，再在各种酶作用下生成黄酮。又如：一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。第二节中药有效成分的提取分离方法提取是指用适当的方法将中药中的化学成分从药材组织中抽提出来的过程。提取前的预处理1、原料的采集基源、产地、药用部位、采集时间、鉴定；2、原料的保存杀酶或抑制酶的活性，新鲜的原料，迅速加热干燥、冷冻保存、用沸水或醇迅速提取；3、粉碎适宜的粉碎度，并非越细越好；4、预处理种子类药材，压榨法或石油醚脱去大量油脂；叶、茎类药材，常要先除去叶绿素等（一）溶剂提取法1、定义溶剂提取法是利用具有合适溶解性能的溶剂把所需的化学成分从药材组织中溶解出来的方法。基本原理（渗透扩散原理）利用可溶性成分形成的细胞内外的浓度差2、影响因素（1）溶剂的选择：a.相似相溶的原理，根据溶剂的极性，被提取成分及共存的其他成分的性质来决定；b.同时兼顾考虑溶剂是否使用安全、易得、价廉、浓缩方便等问题；CHCH3NHCH3CHOHNOHOMeOMeOCH3HNMeOMeOCH3H麻黄碱蝙蝠葛碱(1)化合物分子母核大小（碳数多少）：1.影响化合物极性的因素：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小常见基团极性大小顺序如下:酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷OHOCOCH3O举例：判断下列各组化合物极性大小ABC常见提取溶剂的性质、特点水乙醇亲脂性有机溶剂极性强，穿透力大，价廉、易得、使用安全提取范围广，易于保存、滤过和回收，穿透力强选择性强，提取液易浓缩回收易霉变，难以保存，不易浓缩和滤过穿透力差，毒性大。提取盐类、苷类、糖类、蛋白质溶解极性成分，某些脂性成分也能溶解，使用范围最广的溶剂脂溶性成分，如油脂、挥发油、游离生物碱、苷元等（2）浓度差：形成较大的浓度差；（换溶剂，渗漉等）（3）温度：一般温度高，效率高；（4）药材粉碎度：根据药材的特点，采用不同的粉碎度（5）提取时间：提取时间长，提出效率高；但是当溶液中有效成分达到饱合后，再延长时间也是无用的。其他影响因素1、煎煮法（1）适用范围：不宜用于含挥发性成分、遇热不稳定及含多糖类的药材（2）提取温度：煮沸1小时左右，2-3次（3）优点：操作简单，提取效率高3、提取方法2、浸渍法：包括冷浸法和温浸法（1）适用范围：有效成分遇热易破坏（2）提取温度：常温或40-80C（3）提取时间：浸渍1-2天，共2-3次，合并浸液（4）优点：操作方便，简单易行（5）缺点：提取时间长，效率低，易霉变。3、渗漉法（动态浸提方法）（1）适用范围：遇热不稳定的成分（2）提取温度：常温（3）提取时间：较长（4）优点：保持较好的浓度差（5）缺点：操作不方便，提取溶剂用量大，时间长。渗漉法4、回流提取法（1）适用范围：有效成分对热稳定，易溶于低沸点有机溶剂的天然药材（2）优点：提取效率高（3）缺点：对热不稳定的药材不适用5、连续回流提取法（1）用少量溶剂进行连续循环回流提取，充分将有效成分浸出；（2）溶剂用量少；索氏提取器影响提取效率的因素：水提取：粗粉；有机溶剂：可细些,以20目为好。1.药材粉碎度：药粉越细、表面积越大，提取效率越高。但太细，药粉对成分的吸附也越强。2.提取温度：一般热提效率高，但要考虑有些成分温度高易破坏，应选择适宜温度。3.提取时间：一般提取时间长提出量大。但被提成分在细胞内外溶解一旦平衡，时间长即无意义。一般热水提以1/2-1hr为宜，乙醇提1hr为宜。（二）水蒸气蒸馏法（1）基本原理：水和与水互不相溶的液体成分共存时，其总的蒸气压升高，但沸点降低（低于水的沸点），使有效成分在较低的温度下随水蒸气蒸馏出来；（2）适用范围：挥发性，稳定，难溶于水的天然药物化学成分。如挥发油三、超临界提取法（SFE）1.特点：与经典溶剂提取法比较，不用有机溶剂，而是选用一种称为超临界流体（SupercriticalFluid,简称SF或SCF）的物质替代有机溶剂提取。2.超临界流体（SF）：指处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）状态下的高密度流体，介于气体和液体之间的、以流动形式存在的物质。什么是超临界状态？指当一种物质处于临界温度和临界压力以上的状态下，形成既非液体又非气体的单一状态，称为超临界流体状态。•流体密度近似液体；•黏度近似气体；•其扩散力比液体大；•介电常数也随压力增加而增加；•其浸透性优于液体。•在稍高于临界点的区域内，压力稍有变化，即引起其密度的很大变化，从而引起溶解度的较大变化。特点：具有气体和液体双重特性。因而比液体有更佳的溶解力，有利于溶质的萃取，特别是性质不稳定、易热分解的物质的提取。3.常见的SF：有二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨、二氯二氟甲烷等。1.临界温度接近室温（Tc=31.3℃），临界压力也较低（Pc=7.37Mpa）;2.无色、无毒、无味，不易燃，化学惰性;3.廉价，易制成高纯度气体。二氧化碳的特点：3.常见的SF：有二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨、二氯二氟甲烷等。1.临界温度接近室温（Tc=31.3℃），临界压力也较低（Pc=7.37Mpa）;2.无色、无毒、无味，不易燃，化学惰性;3.廉价，易制成高纯度气体。二氧化碳的特点：四、其他提取升华法利用某些固体化学成分具有较高的蒸气压，受热时不以熔融就可直接气化，气体遇冷又凝固为原来固体化合物的升华的性质进行提取的方法。常见具有升华性的化学成分有游离羟基蒽醌类、小分子游离香豆素类等。超声提取法原理：利用超声波的空化作用a.破坏植物药材细胞，使溶剂易于渗入细胞内;b.同时超声波的强烈振动使浸提的药材和溶剂作高速运动加强胞内物质的释放、扩散和溶解，提高提取效率。溶剂提取法小结常温加热其他浸渍法取时间长，效率低，易霉变渗漉法操作不方便，提取溶剂用量大，时间长煎煮法(水)不宜用于含挥发性成分回流提取法（有机）溶剂消耗量大连续回流提取法耗时长（有机）水蒸气蒸馏法挥发油升华法直接气化超声提取法提高提取效率、缩短时间超临界流体萃取技术设备造价高1.热不稳定2.含大量淀粉，树胶，果胶，黏液质不宜用于遇热不稳定及含多糖类二、中药有效成分的分离精制方法常用的分离方法溶剂法（酸碱法、溶剂分配法）沉淀法（专属试剂沉淀，分机沉淀，盐析）分馏法膜分离升华结晶色谱法（常规柱色谱、加压）（一）溶剂法原理：利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的差异而达到分离的目的。1.溶剂分配法分配系数KK=CU/CLCU在上层浓度CL在下层浓度各种成分在两相当中溶质的浓度相差越大，即分配系数K差异越大，则分离效果就越好。有效成分是亲脂性的，一般多用石油醚、甲苯、三氯甲烷或乙醚；偏亲水性的，则需用乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂进行萃取;天然成分萃取溶剂游离生物碱三氯甲烷黄酮类乙酸乙酯皂苷正丁醇采用萃取法，将总提取物混悬在水中，然后用若干种极性不同且与水不相混溶的溶剂，按溶剂的极性由低到高依次进行萃取；（石油醚，二氯甲烷/乙酸乙酯，正丁醇）系统溶剂萃取法PPAR-γ药理活性实验小极性部分药渣滤液95%乙醇回流提取，过滤石油醚层水层浓缩石油醚萃取乙酸乙酯层水层乙酸乙酯萃取正丁醇层大极性部分多酚类成分浓缩水层鸡血藤原药材（10.0kg）碱性成分酸性成分酚性羧酸类酚类，pKa=9-10；羧酸，pKa=5酸碱溶剂萃取法二、分级沉淀法水提醇沉法水提取液中，加入一定量的乙醇，使含醇量达到80%以上，则难溶于乙醇的成分如淀粉、树胶、粘液质、蛋白质等杂质从溶液中沉淀出来。三、分馏分馏法是利用液体混合物中各组分沸点的差别，通过反复蒸馏来分离液体成分的方法。四、膜分离溶剂、小分子能透过膜，而大分子被膜截留。不同膜过滤被截留的分子大小有区别。膜分离技术：反渗透、超滤、微滤、电渗析。过滤技术五、升华法利用某些固体化学成分具有较高的蒸气压，受热时不以熔融就可直接气化，气体遇冷又凝固为原来固体化合物的升华的性质进行提取的方法。常见具有升华性的化学成分有游离羟基蒽醌类、小分子游离香豆素类等。六、重结晶法利用温度差异对样品溶解度的不同达到分离。结晶溶剂的要求包括对欲纯化的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热都不溶或冷热都易溶；加热溶解，制成过饱合溶液，趁热过滤某些样品由于含少量有色杂质，因此在结晶前可加入适量的活性炭脱色。析出速度太快，往往只能得到无定形粉末单一溶剂不易得到结晶，可选择混合溶剂重结晶法操作利用混合物中各种成分对固定相和流动相亲和作用的差异而使之相互分离。七、色谱法色谱法常规柱色谱（吸附，凝胶，离子交换，大孔树脂，分配）加压柱色谱（高效，中低压）薄层色谱（TLC）1.吸附色谱法absorptionchromatography应用各种固体吸附剂为固定相，利用混合物中各成分对吸附剂的吸附能力差异来进行分离的一种方法。吸附剂的吸附作用主要通过氢键、络合作用、静电引力、范德华力等而产生的。吸附剂（固定相）洗脱剂（流动相）极性大的物质易被吸附;洗脱剂极性越大洗脱能力越强；常用固定相有：硅胶，氧化铝，聚酰胺等1.1硅胶silicagel酸性的多孔性物质，通式SiO2·xH2O硅醇基能与许多化合物形成氢键吸附作用；硅醇基的数目决定其吸附作用的强弱；硅胶吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力就越小，因此硅胶的含水量减小，活度增高，吸附能力越强一般使用梯度洗脱，逐步加大洗脱剂极性适用范围：分离中性、酸性成分1.2氧化铝吸附性强于硅胶，一般为碱性，适合于中性、碱性成分分离1.3聚酰胺高分子聚合物质。不溶于水，甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差。通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物酚羟基；或酰胺基上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产