PCR技术及其应用(全)

目录广西医科大学生物化学与分子生物学教研室贺菽嘉PCR技术及其应用PCR:Polymerasechainreaction聚合酶链反应，亦称DNA的体外扩增技术。目录PCR?PCR只是一个简单的不起眼玩艺——凯利·穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…它最大的特点就是能不断推出新形式。——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]目录PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长目录PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物目录PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶目录PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明1971年，Khorana及其同事提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana等的早期设想被人们遗忘了……目录KaryB.Mullis（1944－）目录引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段目录PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖目录小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。目录94℃55℃37℃变性延伸退火目录Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…thermusaquaticusTaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。目录TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。目录此酶具有以下特点：①耐高温；②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶，便于自动化；③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR得以广泛应用。1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)目录72℃94℃55℃PCR循环目录“Idomybestthinkingwhiledriving”1993Nobelprize目录本章要讲述的主要内容：一、PCR的基本原理二、PCR的体系组成三、PCR的实施四、PCR的结果分析及条件优化五、PCR的类型与应用六、PCR的相关仪器介绍目录一、PCR的基本原理ThepolymerasechainreactionisusedtoamplifyasegmentofDNAthatliesbetweentworegionsofknownsequence.目录TheconceptsofPCRDenaturation:变性Renaturation：复性Semiconservativereplication：半保留复制thedoublestrandDNAopentosinglestrandedDNAtwosinglestrandedDNAformdoublestrandDNAreplication,onemaketwo目录Semi-conservativereplicationOldnewDNA的复制以DNA的两条链为模板，以4×dNTP为原料，按照碱基互补配对的原则，合成子代DNA的过程。目录体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物复习5’3’目录体系组成模板DNA、DDDP、dNTP、SSB引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶DNA复制的基本过程复制的起始复制的延伸复制的终止目录DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB3535复制的起始含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。目录3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物复制的起始目录加热变性复性退火DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。目录threesteps:HowPCRworksDenaturation(变性):90～97℃Annealing(退火):45～65℃Extension(延伸):around72℃目录目录聚合酶链式反应1.Denaturation2.Annealing3.Extension目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增目录LastStep:72℃5-10minAfter25~30cycles?目录PCR技术的特点(1)高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍目录30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon目录(2)特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增目录(3)操作简便易行整个扩增反应可在2～4小时完成。目录总体积50-100lBuffer(Mg2+)缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶二、PCR的体系组成目录5EssentialComponentsofPCRReactionsalts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNA目录技术流程：模板获取引物设计体系建立PCR扩增结果鉴定体系优化三、PCR的实施目录（一）模板的获取来源：病原体标本（病毒,细菌，真菌等）病理生理标本（组织，血液，尿液等）类型：DNA模板RNA模板目录模板单、双链DNA均可，制备RNA模板时要防止降解。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。目录目录DNA提取：酚－氯仿法组织、血液、培养细胞、质粒的提取方法有所不同全血基因组DNA提取：收集WBC（1）取2ml（EDTA抗凝）全血，加入等体积3%的明胶，用滴管抽吸混匀，37℃水浴静置5-10分钟。（2）吸取上清液，3500~4000r/min离心5分钟。（3）弃上清液，留沉淀。目录破碎WBC在留有沉淀的试管中加TES2ml，溶解沉淀。加10%SDS10滴，吸管抽吸混匀，破膜。抽提DNA（1）加入2mlpH7.8的饱和酚，滴管抽吸混匀。3500~4000r/min离心5分钟。（2）取上层水相至另一离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），滴管混匀，3500~4000r/min离心5分钟。目录沉淀DNA将上层水相移至另一试管中，小心加入2.5倍体积的无水乙醇，用滴管吸取上层乙醇沿管壁缓慢冲洗下层溶液（小心），看到DNA絮状沉淀完全析出为止。用吸管吸出絮状沉淀至另一离心管，70%乙醇洗涤2次，放置于冰箱挥干。将上述挥干的DNA加入200μlTE（或者灭菌双蒸水），轻轻震荡，使之溶解。目录2.RNA提取：（1）取组织100~200mg加入7ml离心管中，加PBS缓冲液或Hanks液1ml，高速冰浴匀浆。（2）取上述匀浆200ul至一个1.5ml的离心管中，加TRIZOL500ul，震荡混匀，室温放置10分钟。（3）加氯仿200ul，旋涡震荡1分钟，室温放置2~3分钟。（4）12000r/min冷冻离心10分钟。目录（5）取上清至另一1.5ml的离心管中，加入异丙醇600ul，上下颠倒混匀数次，室温放置10分钟。（6）12000r/min冷冻离心10分钟。（7）小心倒掉上清，用75%的乙醇洗涤1~2次。（8）再离心1~2分钟，用加样枪小心吸掉多余的溶液。（9）室温放置15~20分钟挥干，加DEPC处理水30ul溶解RNA。目录（二）引物的设计引物包括两条，即5’端（上游或正链）引物和3’端（下游或负链）引物。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度下游5’3’上游编码链目录1.引物设计的基本要求：（1）引物长度:15~30bp（2）碱基的分布尽可能随机，避免出现嘌呤或嘧啶碱基的堆积现象。NoGGGorCCCat3’-end,(G+C)45%~55%,Tm=4(G+C)+2(A+T)（3）自身不应该存在互补序列以避免折叠成发夹结构。（4）两条引物间不应该存在互补序列，尤其是应避免3’端的互补重叠。目录（6）3’端的碱基最好是G或C，且一定要与模板配对。（7）5’端的游离碱基不影响PCR反应的进行,因此引物5’端可以修饰，如引入