多克隆抗体的制备方法1

抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。常用的佐剂是福氏佐剂（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。免疫佐剂免疫佐剂（immunoadjuvant）又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性（见抗原）或改变免疫反应类型。种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗）、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物（胞壁酰二肽）等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸（双链多聚腺苷酸、尿苷酸）、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种。不完全佐剂是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）相混合而成，当其再与抗原混合，即成油包水乳剂，可用于免疫注射。在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌，即成为弗氏完全佐剂。完全佐剂的免疫强度大于不完全佐剂。该佐剂主要用于动物实验，不适宜于人类使用。而且动物多次注射后也常会发生佐剂病。免疫佐剂的生物作用包括：（1）抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；（2）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（4）佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；（5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；（7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。具备条件佐剂的条件作为一种良好的佐剂，必须具备下列条件：（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；（4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。常用佐剂的种类和制备佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂(Freundadjuvant)。1．弗氏佐剂弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。一般首次注射时用1／2体积FCA加上1／2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为1：1，制备成油包水乳状液。因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每兔（约2kg重）或每羊（约20kg重）第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：（1）研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。2）注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但同时难以乳化完全，个别抗原，用塑料注射器根本推不动，而用玻璃注射器又有渗漏。制备好的乳化剂经鉴定才能适用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。（3）超声：实验室条件好点的，比如说有超声破碎仪的，一定要控制超声频率和时间，超声容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。乳化方法要根据抗原和需要而定。2．氢氧化铝佐剂取5%硫酸铝溶液250ml，在强烈搅拌下加入5%氢氧化钠溶液100ml，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使达250ml。免疫接种时，取适量氢氧化铝佐剂加等体积抗原即可免疫。3．明矾佐剂钾铝矾(硫酸铝钾)在一定pH条件下产生氢氧化铝胶体吸附抗原而产生佐剂效应。制备方法是用生理盐水溶解蛋白质抗原，在搅拌下缓慢滴入一定量10%硫酸铝钾溶液，用NaOH调pH到6．5，此时溶液变成乳状悬液，离心后去掉上清液，沉淀用生理盐水洗涤二次，加入硫柳汞防腐，4℃保存备用。明矾佐剂一般用于肌肉注射，皮下注射容易引起肉芽肿和脓肿。4．脂质体脂质体包封抗原后，可使抗原延缓释放，并且脂质体颗粒有刺激机体免疫反应的作用。因此，用脂质体包封的抗原免疫动物可提高免疫效果。以抗原免疫动物获得抗血清是制备抗体的经典方法。为了提高免疫效果，在免疫的时候，常辅以佐剂以改变抗原的物理状态而延长其在体内的滞留时间，使抗原缓慢释放，同时非特异性的促进局部吞噬细胞反应来增强动物的免疫效果。佐剂的类型较多，目前常用的还是福氏佐剂(Freund’sAdjuvant，FA)。它是一种对大多数抗原都有效的佐剂，但由于它的一些副作用限制了它在实验动物上的使用。因此，福氏佐剂只能在确实需要的情况下(如使用的抗原为小分子可溶性抗原或半抗原)和强佐剂活性时使用。FA是用矿物油(石蜡油)、乳化剂(羊毛脂)和灭活的分枝杆菌(结核分枝杆菌或卡介苗)组成的油包水乳化佐剂。这三种成分俱全的佐剂称为福氏完全佐剂(Freund’sComD】eleAdjuvant，FCA)，不含分枝杆菌的佐剂为福氏不完全佐剂(Freund’sInconrpleteAdjuvant，FIA)。石蜡油因不能代谢而存留在注射的部位，这就阻碍了抗原降解或快速反应，起到抗原储存作用，使抗原缓慢持续的释放，不断刺激机体的免疫系统而产生免疫反应。乳化剂对于水溶性抗原与油稳定地乳化是必要的。分枝杆菌具有很强的免疫刺激作用，可以非特异性的激活免疫系统。FCA用于基础注射，而FIA用于辅助注射以避免分枝杆菌蛋白引起的过敏反应。FA皮下注射或肌内注射可导致多种副作用，例如肉芽肿和无菌性脓肿的形成。腹腔注射引起腹膜炎。由于这些严重的副作用，FA不允许用于人或动物的疫苗接种免疫。传统的免疫方案，包括使用福氏佐剂和某些免疫程序，已不再被一些国家的权威机构所接受。据调查，在荷兰有64％的研究人员使用FCA，而且，用于多克隆抗体的生产方案差异很大。因此，在1993年，荷兰发布了利用动物免疫技术制备多克隆抗体的生产指南。主要规定了加强免疫注射的次数、免疫途径、注射量和佐剂的使用，并且支持使用替代佐剂来替换FCA。由于FCA给实验动物带来的严重的副反应，对它的使用提出了特别的限制，规定了(小鼠和大鼠sc：0．1nd；i．d：家兔0．o5rI1l；i．P：小鼠0．2nd)推荐使用量和注射途径。（四）免疫方法抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图2-3）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。图2-3抗体反应（五）抗血清的采集与保存家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4。C冰箱保存。（六）抗血清质量的评价在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。1．效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。（1）放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结