糖化酶的固定化及其在葡萄糖-生产中的应用工艺

广州大学实验报告实验名称：糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺学院：生命科学学院专业年级：学号：姓名：组员：指导老师：王小兰、柯德森摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与固定时间的关系。本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化60min时，固定化糖化酶的效率最好；固定化10min时，固定化酶的活力回收为3.47％，偶联率为48.10％，相对活力为7.23％；固定化20min时，固定化酶的活力回收为4.74％，偶联率为54.76％，相对活力为8.66％；固定化30min时，固定化酶的活力回收为4.71％，偶联率为53.42％，相对活力为8.82％；固定化40min时，固定化酶的活力回收为3.84％，偶联率为58.13％，相对活力为6.62％；固定化50min时，固定化酶的活力回收为4.04％，偶联率为60.59％，相对活力为6.67％；固定化60min时，固定化酶的活力回收为6.34％，偶联率为70.00％，相对活力为9.06％。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。关键词：固定化酶效率时间酶活力1、前言：糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性未端切开a-1.4键处，也能缓慢切开a-1.6。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性未端依次切下葡萄单位，在遇到1.6键分割，先将a-1.6键分割，再将a-1.4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法、化学结合法、包埋法。本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等。本实验采用:GF-201大孔强碱阴离子交换树脂，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简单，条件温和，酶活性中心和高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。其缺点是：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强度和pH影响较大。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。2、材料与方法：2.1材料（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6缓冲液)，无水乙醇，盐酸。硫代硫酸钠（0.05M），碘溶液（次碘酸钠，0.1M）。硫酸2M。（2）酶液、固定化酶及固定化后的残留酶液。2.2实验仪器恒温水浴锅（可达99℃，5个），酸度计（3个），容量瓶，量筒，烧杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，锥形瓶，试管架，吸耳球，pH试纸，滤纸，离心机，离心管，分光光度计等。2.3试剂（1）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液A液：（0.1mol/L柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。2.4操作步骤2.4.1试剂的配制（1）糖化酶液：市售商品化糖化酶,去离子pH7的磷酸缓冲液配制，根据标称的活力单位配制为1万单位/ml的溶液，离心去除不溶性杂质，共配4000ml,4℃备用。（2）2mol/L氢氧化钠：8gNaOH-----100ml，共配3000ml。（3）2mol/LHCL:17ml浓盐酸------100ml，共配3000ml。2.4.2固定化酶实验步骤（1）载体的预处理A：乙醇处理：15克湿离子交换剂---50ml烧杯加入30ml去离子水，搅拌，倒去水。注入2倍体积无水乙醇，乙醇浸泡过夜（12h），然后用去离子水连续冲洗以除去乙醇。B：碱处理：2倍体积（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分搅拌，再以去离子水冲至pH6.0-7.0C：酸处理:用2倍体积的2mol/LHCl溶液处理阴离子交换树脂，然后用去离子水洗至pH6.0。D：重复B（2）酶的固定化取4份糖化酶液，每份30ml，分别倒入4个贮液槽中，并各加入预处理的离子交换剂15g，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化。分别在10min、20min、30min、60min后过滤去未固定的酶液，测量每份固定化酶及反应后残留酶液活性。保存固定化后的酶于冰箱以备下一实验。2.4.3葡萄糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管（可用封口胶代替），编号，按表1加入试剂：表1葡萄糖标准曲线制作试剂管号1234567葡萄糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸馏水（mL）2.01.81.41.00.60.20葡萄糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。（2）酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表3-2进行操作。表3-2酶活力测定取样表操作项目淀粉酶活力测定固定化酶活力测定1%淀粉溶液/ml1.01.01.01.01.01.0预保温将各试管和淀粉酶溶液置于40℃恒温水溶液中保温10min淀粉酶原液/ml0.10.10.10.2g0.2g0.2g保温（空白管的酶预先煮沸失活）在40℃恒温水溶液中准确保温5min取反应液0.1ml，加入去1.9ml水，迅速加入以下DNS3,5-二硝基水杨酸/ml2.02.02.002.02.0将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线（煮沸，定容）。，2.4.5装柱模拟葡萄糖的生产将上周保存于冰箱的固定化酶全部装柱，加足够量的淀粉溶液进行洗脱操作，每隔5min取样一次，共取16次。同样处理后在540nm波长下比色测定每个样品的光密度。（3）实验结果处理①在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量（mg）,按下列公式计算酶活力。②酶活力单位（U）=1μmol葡萄糖产生量/min③计算每毫升酶液及每克固定化酶的活力，计算残留酶活力，从而计算酶偶联率及相对活力，评价固定化的效果。3．实验结果及数据分析3.1葡萄糖标准曲线表3葡萄糖标准曲线制作（葡萄糖含量/mg）试管号1234567葡萄糖含量/mg00.20.61.01.41.82.0A54000.0370.1710.3150.4540.6010.655表4原酶吸光值原酶12A5400.2440.272A540平均值0.258酶活力单位0.8199总活力单位819.9表5固定化酶与残留酶吸光值固定化时间（min）A540含量残留酶平均值固定化酶平均值残留液体积（mL）固定化酶含量（g）100.2890.2970.2930.1510.1400.14554517.1200.2980.3420.320.2430.2590.2514715.6300.2690.2530.2610.2390.2270.2334616.1400.2390.2710.2550.2480.2580.2534814500.2370.2190.2280.2860.2480.2674314600.1830.1890.1860.2920.2860.2894816.9y=0.3387x-0.0197R2=0.99800.10.20.30.40.50.60.700.511.52A540nm葡萄糖含量/mg图1葡萄糖标准曲线表6实验结果计算固定化时间（min）残留酶葡萄糖含量（g）固定化酶葡萄糖含量（g）0.1mL残留酶活力单位0.2g固定化酶活力单位残留酶总活力单位固定化酶总活力单位活力回收相对活力偶联率1044.328.348.8641.668425.47228.52283.47％7.23％48.10％2043.1312.478.6262.494370.91838.90644.74％8.66％54.76％3039.7812.017.9562.402381.88838.67224.71％8.82％53.42％4037.3111.277.4622.254343.25231.5563.84％6.62％58.13％5034.3711.856.8742.37323.07833.184.04％6.67％60.59％6027.3315.405.4663.08245.9752.0526.34％9.06％70.00％表7固定化10min第一次生产A540试管号A540淀粉溶液体积（mL）生产时间（min）样品葡萄糖含量总葡萄糖含量葡萄糖生产效率10.1393050.46914.0572.81120.137100.46313.8802.77630.133150.45113.5252.70540.129200.43913.1712.63450.124250.42412.7282.54660.121300.41512.4622.49270.117350.40412.1082.42280.116400.40112.0192.404表8固定化10min第二次生产A540试管号A540淀粉溶液生产时间样品葡萄总葡萄糖葡萄糖生体积（mL）（min）糖含量含量产效率10.1133050.39111.732.34620.102100.35910.772.15430.089150.3209.61.9240.077200.2858.551.7150.059250.2326.961.39260.036300.1644.920.98470.022350.1233.690.73880.018400.1113.330.6664．结论由表5、表6可知，固定化酶的活力回收、相对活力、偶联率均随着固定化的时间的增加而增加，因此固定化酶效果最好的是60min。我们小组做的固定化10min，所以以下分析根据固定化10min的结果进行分析！固定化酶总活力单位加残留酶总活力单位仅为453.9948，而原酶总活力单位有819.9，占比为55%，可能原因有：在固定化过程中，损耗的固定化酶的质量太多；残留液测量不准确；有可能在测量酶活的时候先加入3,5-二硝基水杨酸后加入酶液，导致计算过程中有大误差。00.020.040.060.080.10.120.140.16024681012141618A540试管号