刘秀梵我国新城疫的防控实践和基因VII型新城疫疫苗的研发116-2

我国新城疫的防控实践和基因VII型新城疫疫苗的研发刘秀梵扬州大学兽医学院新城疫是《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》优先防治的5种一类动物疫病之一，在我国也是使用疫苗频率最高的动物疫病。一、ND流行病学研究和我国的防控实践1926年最早发现于印尼爪哇和英国新城1928年我国最早有疑似病例报告1946年梁英和马闻天首次分离鉴定NDV强毒（F48）1950年代引进NDV疫苗毒：Makteswar,B1,F和LaSota株（I、II、III、IV系）后来又引进其他NDV疫苗毒，如V4株等。新城疫（ND）次数持续时间流行毒株的基因型第一次1920年代-1960年前基因II、III、IV型（早期基因型）第二次1960年代-1970年代初基因V和VI（晚期基因型）第三次1970年代后期-1980年代前期基因VIb亚型（晚期基因型）第四次1980年代后期至今基因VII型（晚期基因型）新城疫的四次大流行分子流行病学研究近20年来新城疫在我国家禽中流行的特点主要表现为免疫鸡群中常发生非典型新城疫和对家养水禽的毒力增强——在鹅引起严重临床疾病。这两个流行特点都与新出现的基因VII型病毒有关。①1997年前后在中国出现鹅大批发病的新传染病-鹅副粘病毒病。*确定鹅副粘病毒病是由基因VII型病毒引起的，是鹅的ND；*确定近年来我国鹅群和鸡群流行的NDV强毒95%以上是基因VIId亚型；*确定从鹅分离到的和从鸡分离到的基因VIId亚型病毒没有宿主特异性和致病差异，可以交叉感染发病，互相传播；*常规ND疫苗对鹅的ND保护性差，而用分离的野毒（基因VIId亚型）制成的自家疫苗效果较好，但存在散毒风险。LiuXFetal.ArchVirol,2003;WanHetal.AvianPathol,2004;HuangYetal.ArchVirol,2004;WangYetal.VirolJ,2012②免疫鸡群中的非典型ND，自1980-1990年代以来就普遍发生，而分离到的NDV也都是基因VIId亚型。问题1：新城疫病毒只有一个血清型常规的疫苗还能不能对流行强毒提供有效保护？疫苗免疫保护的3个水平：1.保护不发生死亡，但有部分有临床症状，带毒排毒严重；2.保护不发生死亡，也不出现任何临床症状，一定比例的短时间有带毒、排毒；3.保护不发生死亡，也不出现任何临床症状（包括产蛋下降），很少排毒。这是一个有争议的问题，经过全世界科学界和产业界近30年的努力，现在已基本搞清楚了。Cross-protectionefficacyinchickensimmunizedwiththeLaSotavaccineafterchallengewithvirulentstrainsofdifferentgenotypes(FromQinetal.JclinMicrobiol,2008)实验室研究和现场观察表明，一般情况下，常规疫苗免疫后中等水平抗体（HI6-8log2）只能达到第一种保护水平，高抗体水平（HI9log2以上）可达到第二种保护水平，但达不到第三种保护水平。在第一种保护水平情况下，就发生所谓的非典型新城疫。为了保护不发生死亡也不出现包括产蛋下降在内的临床症状，自1980年代以来，我国的规模化的鸡场就采用的对ND的高频率密集型免疫程序。种鸡和蛋鸡一生接种ND疫苗在10次甚至20次以上，但即使这样，免疫鸡群仍频繁发生非典型ND。因此，常规疫苗对流行的基因VII型已不能提供有效保护。问题2：为什么常规疫苗不能提供对基因VII型NDV强毒的有效保护？1、基因型差异：常规疫苗为基因I、II、III型，属早期基因型，而当前优势流行株为基因VII型，属晚期基因型，遗传差异大；2、抗原差异性：交叉血凝抑制和病毒中和试验证明，疫苗毒和基因VII型流行毒之间抗原性有显著差异（R＜0.2）；基因型IIIVIVIIcVIIdReference数量13164LiuHetal.JVirolMethods，2007277LiuHetal.ResVetSci,200813RuiZPetal.VetMicrobiol,20093Wetal.VirusGene,20102457WuXetal.ArchVirol,201148ZhuJetal.2013总计571262275(其中VII型毒株263)2006年来我国NDV强毒分离株的基因型分布进一步分析显示，2006年至2013年间共报道分离新城疫强毒216株，其中VII型毒株206株，占到了分离株的96%左右，表明基因VII型毒株的分离率正呈上升趋势。NDV流行株与常规疫苗株的遗传关系基因VIId亚型NDV分离株与II型疫苗株的遗传关系较远。基因FHN同源性84.1%～84.4%78.7%～83.0%aNottestedbRvalue=头当R值0.5时，证明毒株间存在明显的抗原差异CrossantigenicreactionbetweenKBNP-4152(VIId)andLaSotabyHIandserumneutralization(SN)tests(FromChoetal.VirusGenes,2007)流行株与疫苗株之间的抗原性差异研究发现流行株KBNP-4152（基因VII型）与LaSota抗原相关性值R为0.18，此外中和试验结果显示LaSota抗血清对KBNP-4152的中和效价仅为KBNP-4152抗血清的0.008（1/128），差异极显著。SerumVirusstrainsLaSotaJS-09-12-ChJS-03-12-ChJS-04-12-ChJS-10-12-ChJS-11-12-ChJS-13-12-ChJS-05-12-ChAnti-LaSota96776666Anti-NDV/VII79889989HItestofanti-LaSotaserumwithpartialstrainsisolatedin2012（log2）HI试验表明，近年来分离的部分流行毒株与LaSota株之间存在较明显的抗原差异，LaSota株血清与自身反应的效价是其与流行毒株的4-8倍。Residues203340342347494495508509514570V4(I型)YYDEGVSTIGLaSota(II型)YYDEGVSTIG分离株（VIId型）HHNE/G/K/DDENIVR流行株HN蛋白上的5个抗原区（193-201位、345-353位、513-521位、494位及569位氨基酸区域）及邻近的氨基酸与疫苗株存在明显的不同。HN蛋白抗原区域氨基酸序列分析国内外实验室研究业已证明：使用与流行株同基因型的疫苗，可有效降低免疫鸡群中NDV强毒的携带量及感染率.基因VII型NDV强毒的致病性特点①与早期病毒F48株（基因IX型）和Hert33株（基因IV型）相比，引起严重的免疫系统损伤，脾脏显著坏死；②与早期病毒F48株（基因IX型）和Hert33株（基因IV型）相比，在体内的复制能力强，呼吸道和肠道的载毒量高，排毒时间长。基因VIId亚型NDV导致脾脏严重的细胞坏死、纤维组织增生和淋巴细胞减少。LaSota免疫鸡群感染VIId亚型NDV与F48E8后的排毒测定（阳性数/样品数）组别HI效价（Log2)攻毒株3日5日7日喉头泄殖腔喉头泄殖腔喉头泄殖腔免疫组6F48E85/10＊0/101/10＊2/10＊0/100/106JS5/0510/103/108/108/100/103/10对鹅的致病性强1997年以来我国鹅群中大面积爆发由基因VII型NDV引起的ND，目前鸭群感染基因VII型NDV强毒的报道也屡见不鲜。因此，当前VIId亚型在我国流行强毒株中已占有绝对优势，而目前在我国禽群中普遍使用的弱毒疫苗株LaSota属于基因II型，其分离于上世纪40年代，距今已有近70年的历史。常用疫苗株与流行株之间的遗传距离较远，抗原性已发生较大变异，以临床症状和排毒率为评价指标已不能提供充分保护，这是免疫鸡群发生非典型ND的根本原因。因此有必要研制与流行株完全匹配的基因VII型新城疫新型疫苗。为了解决困扰我国的免疫鸡群发生非典型新城疫问题和缺乏鹅用新城疫疫苗的问题，我们经过10多年的努力，研制成基因VII型新城疫疫苗，并于2014年11月17日获得国家一类新兽药注册证书。二、基因VII型新城疫疫苗的研发*必须是低致病性，最好比LaSota低；*必须在鸡胚和细胞上繁殖性能好，产生毒价高（与LaSota比）；*必须免疫原性好，与流行毒株的匹配性好，产生的免疫应答优于LaSota。这样的种毒必须通过反向遗传技术对基因VII型NDV强毒进行遗传改造。1、基因VII型ND疫苗的种毒有哪些要求？2、NDV强毒反向遗传技术平台的建立①第一个基因VII型NDV强毒ZJ1株的全基因组序列测定，为反向遗传平台建立打下基础。重大发现：晚期基因型（V、VI、VII、VIII）和过渡基因型(IX)NDV，基因组全长为15192nt，比早期基因型（I、II、III、IV）在NP基因的非编码区多6nt的插入。HuangYetal.ArchVirol,2004②NDV强毒反向遗传技术平台建立:*ZJI-GFP拯救成功LiuYLetal.ArchVirol,2004基因VIId亚型NDVA-VII株的拯救LiuYL,etal.ArchVirol,2007HuSL,etal.Vaccine,2009A-VII型强毒致弱株的拯救提高致弱株的免疫原性和繁殖能力—疫苗种毒候选株的确定A-VII株的系统鉴定—实验室鉴定A-VII株申请发明专利（2007）A-VII株的系统鉴定—工业化生产疫苗种毒的性能)。NDV基因VII型疫苗种毒的研究GenerationofA-VIIviaattenuationTrailer5'LeaderNPPFHNL3'M122159118873080329643904550621164188153838715001HuSL,etal.Vaccine,2009VirusesPathogenicityAllantoicfluidstiterMDTICPIEID50/0.1mlHAE1120h0.3108.810log2E5120h0.16109.1711log2E10120h0.22109.311log2E15120h0.17108.810log2重组病毒A-VII生物学特性的鉴定根据ICPI和MDT指标，A-VII株的毒力比LaSota低，用作疫苗毒株安全性好。以鸡胚繁殖病毒，尿囊液中A-VII株的HA≥10log2。免疫后不同时间抗体HI效价上升曲线﹡均以自身免疫毒株作为4单位病毒效检试验结果显示，致弱株A-VII免疫原性强，其灭活苗以较低剂量（20ul）免疫SPF鸡时即可产生高滴度的HI抗体，且其诱导抗体产生的速度较LaSota快。02468107天14天21天HI效价(log2)A-VII-kLaSota-kImmuneefficacyofNDV/A-VIIinchickensFrequencyofisolationofchallengevirusincommercialchickensaC:challengedwith105ELD50JS2/06.bO:Oropharyngealswabs.cC:Cloacalswabs.dNS:nosurvivors.GroupaPost-challengesamples(no.positive/total)Day2Day4Day7Day10ObCcOCOCOCPBS-C10/1010/1010/1010/10NSdNSNSNSL-A-VII-C8/103/101/103/100/101/100/100/10L-Las-C10/103/103/106/100/102/100/100/10Oil-A-VII-C5/10*0/102/102/100/101/100/100/10Oil-Las-C9/100/104/104/101/100/100/100/10(A)Meanvirustitersoforop