ELISA标准曲线分析及应用

1ELISA技术在检测中的应用及数据分析软件应用刘平2010.3.12目录•ELISA技术基本原理•ELISA技术在食品安全检测中的应用•ELISA试剂盒数据分析•标准曲线•分析软件的详细介绍和数据判定经验分享2ELISA原理•ELISA的定义•ELISA的类型•ELISA技术的特性•ELISA技术必备的几个基本试剂ELISAELISA中常用名词中常用名词••半抗原半抗原••抗原抗原••载体载体••抗体抗体••稳定性稳定性••特异性特异性••准确度准确度••灵敏度灵敏度••精密度精密度•检测限•定量限•半定量•标准曲线与线性•IC503食品安全检测中的应用•在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物的药物和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应稀释倍数即可得出样本中药物的残留量。检测项目•兽药残留抗生素分析；如氯霉素、硝基呋喃类、四环素类等。•有害添加物；如孔雀石绿、结晶紫、吊白块、三聚氰胺等。•毒素；如生物毒素、食源性致病菌、细菌毒素、真菌毒素等。•微生物：如沙门氏菌、李斯特氏菌、致病性弧菌、弯曲杆菌等。•激素：如已烯雌酚、睾酮等•农药残留•转基因食品•食品过敏原•其他4ELISA检测流程后加先加酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶后加A液先加B液酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶H2SO4洗洗板板洗洗板板显色显色混匀混匀拍拍干干注意事项•实验前•实验中•实验后5数据分析•结果判定有三种方法，简单判定可用第1种方法，粗略判定可用第2种方法，定量判定用第3种方法。注意样本吸光值与药物的含量成负相关。判定方法一标准品显色情况标准1标准2标准3标准4标准5标准6样本1样本2样本1的显色情况可以看出大概在标准2与标准1的颜色之间，即可得出其样本中的待测物含量在标准1与标准2之间，再乘上样本的稀释倍数以后即可得出该样本的最终含量范围。同理可以看出样本的检测含量在标准5与标准6的浓度之间，再乘上样本的稀释倍数以后即得到该样本的大概含量。6判定方法二•用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。例如样本1的吸光度值为0.236，样本2的吸光度值为0.666，标准品吸光度值分别是：0ppb为1.949；0.05ppb为1.434；0.15ppb为0.939；0.45ppb为0.487；1.35ppb为0.157；4.05ppb为0.060。则样本1的浓度范围是0.45ppb-1.35ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中药物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.15ppb-0.45ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中药物残留的浓度范围。判定方法三百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝（B/B0）×100%标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以被检测药物的标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中药物的实际浓度。7坐标轴标准曲线•S形曲线：是典型剂量反应曲线，多见于剂量－质反应关系中，分为对称S形曲线和非对称S形曲线两种形式。•直线：化学物质剂量的变化与反应的改变成正比。•抛物线：为一条线陡峭后平缓的曲线，类似于数学中的对数曲线，又称为对数曲线型。8拟合曲线•用于免疫检测的所谓“标准曲线”其实称为拟合曲线比较合适。免疫检测时标准点（可以是倍比稀释的，也可以不是）浓度如果和相应的吸光度（OD）值如果能够呈现直线关系当然是最理想的了，这时可以通过EXCEL等方便的获得拟合曲线，进而推算出样品的浓度值。但我们做免疫检测很少有时候能够有这么理想的情况，标品浓度和相应OD值往往是S型的曲线关系，这时就不能用直线拟合的方式了，而对拟合方法进行选择就是必要的了。曲线拟合方式•关于标准曲线的拟合方式，直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合，但都只适用于曲线的一部分，有的适用于前半段，有的适用于后半段，有的适用于中间一段，而Logistic曲线则对曲线的全部都有较好的适用性。当然，如果用于定量，还是在中间一段较好。这些方法虽然没有一种方法可以通用，但也都可以用。关键在于你的标准曲线做到了S形的哪一部分，你想检测的样品浓度在曲线的哪一部分。在S曲线的低浓度部分可以用乘幂方程很好的拟合，中低浓度部分可以用直线方程，中间部分可用对数方程，而中后段可用四参数。9生物学采用拟合方式•目前国际上最流行的免疫检测拟合方式是“四参数逻辑拟合”，用这种拟合方式往往能够比较精确的反映浓度和吸光度的曲线关系，从而进一步比较正确的获得样品中待测物质的浓度值。•其实，在一个长的区间内，Logistic应该都能拟合得较为理想。但并不是说它就是万能的。事实上不仅是ELISA，其它很多生物学反应都是S形曲线，也都可以用Logistic曲线拟合。但建模型是一回事，而用它来定量是另一回事。如果用来定量，S形曲线的中间段（较陡处）是比较好的，而两端的平坦部分计算误差会大，有时甚至会很大。•国内外的定量试剂盒往往严格规定了较窄的使用浓度范围，实际上是一种偷懒的做法，为了避免叫你选择不同类型的标准公式。生物反应曲线10标准曲线典型曲线1IC50=55.8ppb拐点数：111典型曲线2IC50=21.8ppb拐点数：2典型曲线3IC50=26.2ppb拐点数：212软件分析过程主界面13设置界面设置完成14排板及数据曲线查看15标准曲线参数IC50拐点数查看结果16排版标准品序列号标准品信息B/B0标准品吸光度值标准品实测浓度变异系数样本吸光度实测浓度稀释倍数样本浓度样品序列号标准品浓度样本信息17标准品参数样本结果18回归曲线回归参数线性19稀释倍数修改20新版软件旧版1.08新版1.56选择检测项目食物与饲料临床检测过敏原检测最近数据21新旧软件界面四点回归新版排版22对比旧新结果对比23四点回归曲线曲线参数24结果结果对比25EXCEL软件分析EXCEL软件参数26EXCEL结果结果对比27总结•新旧版软件结果的差异不大，基本不影响结果判定。•软件内二种判定结果方式结果差异不大，对结果影响较少，建议使用官方推荐数据处理方法进行判定。•EXCEL软件结果较其他几种方式差异略大。谢谢！联系方式：Tel：[phone]-606&307Mobile：[phone]E-nail：[e-mail]:179942748MSN:[e-mail]28实验前•检查酶标仪和打印机工作是否正常。•试剂盒反应温度为25度或37度，要提前开空调或恒温箱，并调整好温度。•使用之前将所有试剂温度回升至室温25℃。使用之后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。•洗板所用水为去离子水，若没有制备去离子水的仪器，也可使用纯净水。29实验中•在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。•反应终止液为硫酸，避免接触皮肤。•不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。实验后•储存条件保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。•试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（OD450nm0.5）时，表示试剂可能变质。30定义1.1.半抗原半抗原::只有免疫反应性,而无免疫原性的小分子物质.如药物,多糖,类脂等2.2.抗原抗原::凡是能刺激机体产生免疫应答并能与应答产物特异结合的物质3.3.载体载体::赋予半抗原具有免疫原性的蛋白质分子,即为载体.4.4.抗体抗体::可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白5.5.稳定性稳定性::通常用户指的稳定性既指试剂盒的保存期，又指试剂盒不同批次的均一性6.6.特异性特异性::试剂盒特异性一般指试剂盒出现假阳性或假阴性的概率7.7.准确度准确度::一般用回收率来表示,是评价试剂盒好外的重要指标定义8.8.灵敏度灵敏度::指测定值(平均值)与真实值的接近程度,表示分析结果的正确性.由于无法知道榈的真实浓度,故通常采用添加回收率来表示:回收率=(测定值-空白值)/添加量9.精密度精密度::指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度,表示分析结果的重复性.10.检测限:检测限指分析方法能够从榈的背景信号中检测出待测物存在时所需的最低浓度.11.定量限:指分析方法能够对样品中的待测物进行定量测定的最低浓度.12.IC50::是指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度,这里的反应可以是酶催化反应,抗原抗体反应等。31ELISA定义•ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。（Enzyme-LinkedImmunosorbentAs-say）二、必备试剂：二、必备试剂：ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物1.已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）2.酶标记的抗原或抗体（结合物）3.酶的底物4.阴性对照品和阳性对照品，参考标准品5.结合物及标本的稀释液6.洗涤液7.酶反应终止液32类型1.双抗体夹心法测抗原2.双抗原夹心法测抗体3.间接法测抗体4.竞争法测抗体或抗原1.抗原抗体反应的特点1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。331.2敏感性①化学比色法的敏感度为mg/ml水平。②酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。③免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。④标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，氯霉素、呋喃唑酮类药物，其敏感度可达0.05ng/ml以下。1.3特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。即“钥匙与锁”的关系。与类似物的交叉反应率是评价特异性的技术指标。