Lowry法测定蛋白质浓度

Lowry法测定蛋白质浓度1.原理本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜—蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。2.试剂（1）酚试剂来源：a.配制：取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）l00g和钼酸钠（Na2MoO3）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水，85%磷酸50ml，盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10h。取下回流管，加入l硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴液几滴，煮沸约15min，去除过量的溴，冷却加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。酚试剂贮备液用NaOH滴定液（0.5mol/L）测定酸浓度，然后加水稀释至相当于1mol/L盐酸浓度。b.购买：市售酚试剂在使用前用0.5mol/LNaOH滴定液，以酚酞为指示剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。（2）碱性铜溶液取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)溶液各0.5ml，4％碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.8%NaOH溶液各25ml，摇匀，即得（注：现用现配）。（3）0.5mol/LNaOH滴定液的配制及标定取NaOH适量，加水搅拌使溶液成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静止数日，澄清后，取澄清的NaOH饱和溶液28ml，加新煮沸后冷却的水，使成1000ml，摇匀。取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新煮过的冷水50ml,摇匀，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1mlNaOH滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。（4）标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品1支，用水定量稀释至每1ml含1mg,作为贮备液。精密量取贮备液2.5ml至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为每1ml含100μg的标准蛋白质溶液。3.测定方法精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，加水至1ml，加碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10min，快速加入酚试剂0.5ml,摇匀，室温放置30min，显色后，照紫外—可见光光度法，在波长650nm处测定吸光度（显色后，如发现混浊，3000r/min，离心15min，取上清液测定）。精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，加水至1ml，加碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10min，快速加入酚试剂0.5ml,摇匀，室温放置30min，显色后，照紫外—可见光光度法，在波长650nm处测定吸光度（显色后，如发现混浊，3000r/min，离心15min，取上清液测定）。准确量取1ml水作空白对照，具体操作方法同上。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，取直线回归方程，将测定供试品的吸光度代人直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。