突变体鉴定

作物突变体的细胞学研究一、突变体的初步观察和遗传分析在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F1世代；将得到的F1自交得到各个的F2世代；将F1与M进行回交，分别得到对应的BC1世代；如果需要，还可以继续回交得BC2等世代。观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状；分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制；结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F1突变性状，可判别突变性状为隐性或显性；统计分析F2和BC1世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。二、突变体的细胞学观察核型分析原理与步骤核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。染色体数目以该植物的体细胞为准，计数30个以上染色体分散良好的细胞，85%以上的细胞中染色体数目稳定在一个数目上，则这个数就是该植物的染色体数。染色体形态作为核型分析的染色体,一般以体细胞分裂中期的染色体作为基本形态。此外,如果减数分裂粗线期的染色体分散良好,着丝点清晰者,也可用作核型分析。细胞数要求5个以上，且所统计的细胞的染色体要清晰，图像质量要高。a染色体长度绝对长度或实际长度均以微米表示。一般宜在放大的照片或图象上进行测量,然后按下式换算（放大的染色体长度mm/照片中标准长度mm）×10um由于预处理条件和染色体缩短的程度不同,所以,即使同一种植物，不同作者所测得的绝对长度值,也往往有明显差异,这是无法避免的。绝对长度值只在某些情况下有相对的比较价值，在许多情况下，它不是一个可靠的比较数值，所以要测量相对长度。相对长度均用百分数表示，相对长度=试剂长度/染色体组长度×100%染色体长度比则指核型中最长染色体与最短染色体的比值。即最长染色体长度/最短染色体长度。b、染色体的臂比其计算公式如下臂比=长臂/短臂c、着丝粒位置臂比值着丝粒位置英文简写1正中部着丝点M1.01-1.70中部着丝点区m1.71-3.00近中部着丝点区Sm3.01-7.00近端部着丝点区St7.01以上端部着丝点区s∞端部着丝点Sd、臂指数或称NF值，即在细胞分裂后期中把中部和近中部着丝点的“V”形染色体计算为两个臂，而把具近端和端部着丝点的“J”或“I”型染色体计算为一个臂，以此来统计核型中的总臂数。e、染色体编号通常按染色体长度编号，如果两对染色体长度相等，则按短臂长度排列，长者在前，短者在后。性染色体排在最后。f、染色体组式指人为将染色体按相对长度，依大型（large,L）、中型（middle,M）、小型（small,S）及性染色体顺序记数并列成简式，以明了染色体的构成成分。通常大型染色体是指相对长度在10.00以上的染色体，中型染色体指相对相对范围在5～10的染色体，而5.00以下的为小型染色体。将照片剪分成各单个的染色体按表型特征将全部染色体配同源对（或同源组），配对的根据是随体的有无及大小，臂比是否相等，染色体长度是否相等。将染色体全部的同源对排列①全部着丝点对齐在同一水平线上，②短臂朝上长臂在下，③按大小降序从左到右依次排队（等长的染色体，短臂长者排在前头），④具随体染色体、性染色体排放在最后（蚕豆染色体组型例外）；若有二对以上具随体染色体，则大随体染色体在前，小随体染色体在后。编上序号将排好的染色体对（组）按先后顺序粘贴在绘图纸上，编上序号突变体核型分析分别取突变株或者突变株系分生组织细胞和花粉母细胞制片，进行核型分析。统计体细胞染色体的数目，判别是否有染色体加倍、减半、单体、三体、四体等染色体数目变异的的出现；体细胞中观察统计分析染色体长度、着丝点位置、臂比、以及臂指数等，判别是否有染色体结构上的变异，如缺失、易位、倒位等。分析突变体材料花粉母细胞减数分裂中期I染色体的联会情况，统计染色体的缺失圈、倒位圈以及易位的十字形交叉的数量以及所对应的染色体的号数。从而了解其染色体的同源性，判别是否有外源染色体，初步推测突变性状的变异来源。三、连锁群测验与连锁图位置的确定连锁群测验经典细胞遗传学已经发展出多种精密设计的实验来确定基因所属的连锁群或染色体。在染色体数目较少或者染色体变异尚未充分积累的生物中，可运用现有的连锁群的遗传标记材料进行测验，即要具备一套常规的测验种，以每一条染色体为单位，在上面要有一个或几个性状易于识别的标记基因。最适于做标记的是种子形状和幼苗性状，因为这些性状分类方便，在操作时可以节省时间和费用。方法是把新突变体与各连锁群测验种进行一次杂交，F1进行自交或测交，从F2或测交后代的独立性测验中来群定新突变体与各连锁群标记基因的关系。在玉米中，曾经应用的一个多隐性测验种，在每一条染色体上都有一个隐形标记基因，可以作为识别连锁群的预备材料。果蝇的连锁群测验种，只运用Ⅱ号和Ⅲ号染色体上的两个纯合致死基因作标记，加上第一号染色体上基因的性连锁遗传现象，就可以准确无误地测定每一个新突变体连锁群的归属。三体的应用染色体变异是确定基因所属连锁群的强有力工具。在2n植物中，三体株可以正常发育，并且通过母体传递一定比例的n+1配子。三体染色体上的基因，杂交后代分离比例与二体的有明显不同，因而可以有效地进行基因连锁群的测定。端体三体、次级三体和三级三体还可以用来确定未知基因所属的染色体臂。单体的应用异源多倍体植物，如小麦、烟草等，由于单体株可以正常成活，可以通过母体大量传递n-1配子，因而利用单体测定连锁群变得简单易行。单端二体也可以用来确定基因所属的染色体臂。易位的应用利用染色体相互易位来测定基因所属连锁群曾是玉米遗传研究的常用方法，它比三体法更有效。因为易位断点可有标记染色体的每一个部位，杂易位产生的花粉和胚乳半不育性是非常清楚的遗传标记。玉米遗传家又积累了一套胚乳标记基因如su（甜）、wx（糯）与易位断点密切连锁的材料，可以在室内根据胚乳性状对T和t进行分类、使连锁群的测定更趋简化。连锁图位置的确定当知道了基因所属连锁群之后，下一步是确定该基因在连锁图上的具体位置，以及与其他基因之间的关系。要做到这一步，就需要选择该染色体两臂上适当的连锁基因组合作测验种，进行三点或多点测验。先让突变体与两臂的测验种进行杂交，F1代在可能的情况下与多隐性材料进行回交（测交），从回交后代出现的类型和比例就可以计算出突变基因与其他基因之间的距离，从而把它们标定在连锁图的相应位置上。回交若有困难，像自花授粉作物，也可以进行自交。根据F2资料来计算交换值。原位杂交原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。FISH是原位杂交技术大家族中的一员，它检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。将突变植株系与野生系进行DNA原位杂交，利用原位杂交技术构建突变体系的DNA物理图谱，从而对之前粗略定位的突变性状对应基因进行更精细的定位。选择细胞周期中不同时期的细胞进行定位，则其分辨率也有所不同。见表一后记在对突变基因进行较精细的定位后则可以继续以后的一系列相应研究，如该基因的分子生物学定位，该基因的相关调控表达，该基因的克隆，以及转基因研究等。