基因工程抗体-百替生物

@100biotech.com第五章基因工程抗体分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。自1975年Milstein和kÖhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。第一节免疫球蛋白概述免疫球蛋白（immunoglobulin）是指具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。它是介导体液免疫重要的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可作为B细胞表面跨膜受体，参与膜信号转导，促进B细胞的激活、分化及凋亡。血浆中分泌型抗体，具有中和抗原、激活补体或介导细胞毒作用等功能。一、抗体的生成理论侧链学说(Sidechaintheory)，模板学说(Templatetheory)，克隆选择学说(clonalselectiontheory)二、抗体的结构1、轻链与重链Ig分子由两条轻链（lightchain,L）和两条重链（heavychain,H）组成。轻链的分子量约为24kD，重链的分子量约为55kD或77kD。轻链的种类有两种，即和。在同一Ig分子中，两条轻链是同型（isotype）的。重链的种类有5种，即、、、和。根据重链的种类不同，可将免疫球蛋白分子分为5类：IgM（链）、IgD（链）、IgG（链）、IgE（链）和IgA（链）。相同的两条重链轻链间二硫键（disulfide）连接呈“Y”型。相同的两条轻链也分别由链间的二硫键与“Y”型重链的双臂相连。2、免疫球蛋白分子的区域结构V（variableregion,V）区C（constantregion,C）区绞链区(hingeregion)Fv区：轻链和重链的可变区相互作用形成Fv，为抗原结合部位。可变区因氨基酸序列较多变异而得名。但事实上氨基酸序列的变异并非随机均匀地分布在整个可变区，而是集中在几个较小的区域被成为高变区或超变区（hypervariableregion），在一个完整的Ig分子内，L链的3个超变区和H链的3个超变区共同形成一个三维空间的抗原面。由于超变区在结构上与抗原互补，因此也称互补决定区（complementaritydeterminingregion,CDR）。在立体构象中，它们位于Fv的末端，直接参与抗体与抗原的结合。3、免疫球蛋白分子的空间构象@100biotech.com图5-1人Ig轻链多肽折叠示意图从图5-1可以看出，免疫球蛋白分子的空间构象是由组成Ig分子的多肽链折叠而成的。图中白色箭头表示-折叠结构内的多肽排列，黑色条带表示链内二硫键，数字表示从N端起的氨基酸的位置。浅黑色条带表示V区CDR1、CDR2和CDR3环，它们一起形成轻链的抗原结构。轻链折叠成VL和CL两个Ig区，即免疫球蛋白折叠（IGfold）或抗体折叠。每个Ig区肽链长度为原来的1/2，各含110个氨基酸。Ig区为二层反向平行多肽组成的-折叠片层结构。其中一层含有三条反向平行肽链，另一层则由四条反向平行的肽链组成。两个-折叠片层间通过二硫键相连。V区的折叠主要决定于各CDR之间框架区内氨基酸序列的保守性。如V区序列中含有的约90个氨基酸构成的内二硫环（internaldisulfideloop）。V区折叠之后，CDRS则突出于N端表面形成抗原结合部位。轻链C区的羧基端也形成一个Ig区。三、抗体的功能1、与抗原特异性结合2、激活补体3、Fc受体介导的效应功能第二节免疫球蛋白的基因结构一、免疫球蛋白基因的染色体定位所研究过的物种中，它们的胚系Ig基因基本相同。编码Ig分子的Ig、Ig和IgH基因为三个不连锁的基因，分别定位于不同的染色体上。目前已知，人的上述三个基因座分别定位于第2、22和14号染色体上；小鼠的则分别定位于第6、16和12号染色体上。Ig轻链和重链基因座分别由编码V区和C区的一些基因组成，各基因分别被非编码DNA序列隔开。二、免疫球蛋白基因结构和重排1、重链基因结构和重排（1）V区基因H链V区基因由V、D、J三种片段经重排后组成。人的VH基因片段100个，小鼠的为250~1000个。L1为转录起始信号。VH编码V区N端的98个氨基酸残基，CDR1和CDR2也包括在内。D和J基因片段位于V、C基因片段之间，长度共30~50bp。D基因只存在于H链，L链则无。小鼠的DH为12个片段，人的则多于20个。小鼠的JH有4个片段，人的有9个，其中6个为功能性基因，3个为伪基因。DH和JH共同编码V区的羧基端和CDR3。H链V基因座有100~200个基因片段，共同组成多基因家族。每个家族成员有70%~80%的核苷酸序列是相同的。人类有6个VH基因家族，每一家族有2~60个成员。（2）C区基因H链C区基因位于3ˊ端，呈串联排列，每一基因由3~4个长度相同的外显子组成。人H链C区基因共有9个，另外还有两个假基因C2和C。从5ˊ端到3ˊ端的排列顺序为@100biotech.comC-C-C3-C1-C2-C1-C-C2-C4-C1-C2。小鼠C区基因片段为C-C-C3-C1-C2b-C2a-C-C。2、轻链基因结构和重排L链可变区基因片段重排发生在IgH链基因重排之后，其间，链基因先发生重排。如果基因为无效重排，之后便引起基因的重排。V或V基因片段编码L链的CDR1、CDR2和CDR3的大部分。J或J基因片段编码CDR3的其余部分和第四骨架区。V编码95个氨基酸残基，J编码从96位至108位氨基酸。L链不含D基因片段（1）链基因结构和重排基因是由V、J和C3个基因片段经重排后组成的。V与C之间的重排为随机方式。人V基因片段约有100个，J基因片段有5个，C仅为一个。小鼠V基因片段约为250个，J5个（其中4个为功能基因），C也仅有1个。（2）链基因结构和重排链基因同样有V、J和C3个基因片段经重排后组成。人链基因重排的确切情况至今还不清楚，但已知其V约有100个，C的数目至少有6个，每个C与各自的J基因片段相连。小鼠链的基因重排比较复杂。V基因片段有3个（V1、V2、VX），J和C各有4个基因片段，可分为两组。即，J2C2、J4C4、和J3C3、J1C1。图5-2显示免疫球蛋白的基因结构。图5-2免疫球蛋白基因结构第三节单克隆抗体单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb):由识别一种抗原决定基的细胞克隆所产生的均一性抗体。1975年Milstein和kÖhler首次成功地将绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过筛选、克隆化培养等步骤，制备出小鼠抗绵羊红细胞单克隆抗体。这一技术的问世，在医学生物学领域产生了重大的影响。一、单克隆抗体制备的基本原理致敏的B淋巴细胞能分泌特异性抗体，但这些细胞不能在体外存活。骨髓瘤细胞可在体外大量繁IGH（位于染色体14q32）IGK（位于染色体2p12-p11）IGL（位于染色体22q11）VVDDDDVVDDDDJJJJMDG3G1EP1A1GPG2G4E1A2VVVVVVVVJJJJJK着丝粒VVVVVVVPREB1VVJ1L1J2L2J3L3J4L4J5L5J6L6J7L7IGLL1IGLL2IGLL360个IGLV7个IGLJ与7个IGLC交替排列3个IGLL基因座多于90个IGKV5个IGKJIGKC11个IGKVorphons95个IGHV23个IGHD9个IGHD9个IGHJ11个IG[e-mail]殖，但不能分泌特异性的抗体，若将小鼠的骨髓瘤细胞与这些能够分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性，又具有B淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力。由于每个致敏的B淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体，所以克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一抗原决定簇的单克隆抗体，这就是单克隆抗体制备的基本原理（图5-3）。二、小鼠—小鼠B淋巴细胞杂交瘤小鼠—小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术是应用最广泛的杂交瘤技术，其优点在于：小鼠骨髓瘤细胞比较稳定，容易获得，容易培养；使用小鼠作为免疫动物所需抗原量较少，操作简便，并容易获得好的免疫效果；融合成功的杂交瘤细胞属于同种属杂交细胞，传代较稳定，不容易发生变异。这一技术不足之处在于：鼠源的单克隆抗体不能直接用于临床治疗，目前只限于基础研究及体外诊断试剂。1、小鼠骨髓瘤细胞（1）稳定，易培养；（2）自身不分泌免疫球蛋白；（3）融合率高；（4）是HGPRT缺陷株。2、免疫B淋巴细胞（1）免疫动物：用目的抗原刺激机体，使机体产生致敏的B淋巴细胞，免疫成功的标志是在融合时脾脏能提供大量处于增殖状态的特异性B淋巴细胞。（2）免疫效果检测：免疫2—3次后，可从眼眶取血检测血清效价。3、细胞融合（1）收集骨髓瘤细胞（2）收集B淋巴细胞（3）细胞融合：聚乙二醇（polythyleneglycol）4、融合细胞的接种与选择培养5、杂交瘤细胞的检测6、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养7、单克隆抗体性质的鉴定8、单克隆抗体的生产9、单克隆抗体的提纯最近几年一些新的医学生物学技术被引入人单克隆抗体的制备。这些新技术大致有两类：一是利用转基因小鼠或某些新品系小鼠如SCID小鼠（severecombinedimmuno-deficientdisease）来制备人单克隆抗体；二是制备各种基因工程抗体。第一种途径是希望通过转基因小鼠或某些新品系小鼠进行各种抗原免疫，在小鼠体内产生人的免疫B淋巴细胞，在通过经典的小鼠-小鼠杂交瘤技术制备出能分泌人单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株。SCID小鼠是CD-17纯系小鼠16号染色体上的基因发生了突变，破坏了免疫球蛋白基因和T细胞受体基因的重排，从而导致缺乏成熟的功能性T和B淋巴细@100biotech.com图5-3单克隆抗体的制备过程胞所形成的联合免疫缺陷症。这种缺陷决定了它可以接受人体器官和组织转移物，形成人-鼠嵌合体，即hu-SCID小鼠。转基因鼠是将人的胚系免疫球蛋白基因插入小鼠受精卵染色体中，使小鼠具备产生人抗体的能力，并传给子代。这一技术的难点在于如何使目的基因（人抗体重链和轻链基因）在小鼠@100biotech.com体内正确表达。这一技术的有效应用有赖于转基因动物技术的提高与发展。第二条途径是希望通过基因工程手段，改造鼠单克隆抗体或重建人单克隆抗体。基因工程抗体在下一节详细介绍。第四节基因工程抗体血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体技术以及DNA重组技术的发展，促进了基因工程抗体技术的产生，从而使抗体的研制进入了第三阶段，研究也从细胞水平进入到分子水平。基因工程抗体是指利用DNA重组技术和蛋白质工程技术对编码抗体分子基因按不同需要进行加工改造和重新装配，再转染到合适的受体细胞所表达的抗体分子。基因工程抗体技术，包括人鼠嵌合抗体（c