AMPK自噬通路在骨髓间充质干细胞心肌保护中的作用及机制研究

AMPK/自噬通路在骨髓间充质干细胞心肌保护中的作用及机制研究vivian2021/2/23内容简介：祖细胞可通过多种效应起到对受损心脏的修复作用，是现流行的一种治疗心脏疾病的有效方法。其作用机制涉及自噬过程，本文对自噬发生过程涉及的各个环节做了详细的说明，以及总结了目前研究自噬的方法。1.骨髓间充质干细胞（BMSCs）在治疗心脏疾病中的作用4祖细胞治疗心脏病变EPCsBoneMarrowMSCsHSCsHeartResidentcardiacstemcellsLiverSkeletalMuscleAdiposeTissueStemCellsEndothelialcellsCardiomyocytesHeartrepairMSCsTrophicfactorsHGF、G/M-CSF、VEGF、IGF-2reducingtissueinjuryinhibitingfibroticremodelingpromotingangiogenesisstimulatingrecruitmentandproliferationofstemcellsreducinginflammatoryoxidativestress2.自噬与心脏的关系6CM：cardiomyocytes心脏疾病病变凋亡自噬7自噬（autophagy）是继凋亡后，当前生命科学最热的研究领域。比利时科学家ChristiandeDuve在上世纪50年代通过电镜观察到自噬（autophagosome）结构，并且在1963年溶酶体国际会议上首先提出了“自噬”这种说法。ChristiandeDuve被公认为自噬研究的鼻祖，他也因发现溶酶体，于1974年获得诺贝尔奖。自噬背景8自噬基因（autophagy-relatedgene，ATG）的克隆始于酵母（yeast）。第一个酵母自噬基因（ATG）于1997年被日本科学家YoshinoriOhsumi小组克隆，命名为Atg1。第一个哺乳动物自噬基因于1998年被美国科学家BethLevine小组克隆，命名为Beclin1。截止到2010年9月已经克隆34个ATG基因。背景9目前自噬最前沿的三个领域：1）自噬体膜的来源问题2）细胞器自噬，特别是线粒体自噬（mitophagy）3）Beclin1复合物的形成和调控蛋白以及mTOR信号通路在自噬中的作用背景10自噬过程11classIIIphosphatidylinositol3-kinase/Vps34andBeclin1(Atg6)complexisolatedmemberancerecruitingAtgproteinstwoubiquitin-likeproteinconjugationpathwaysAtg12-Atg5Atg8/LC3-PEAtg16LAtg12-Atg5-Atg16LAtg5-dependentlocalizationelongationautophagosomeAutophageactivitedAtg调控机制12Atg12首先由E1样酶Atg7活化，之后转运至E2样酶Atg10，最后与Atg5结合，形成自噬体前体（Autophagosomalprecursor）。13哺乳动物LC3前体合成之后，在Atg4同源物的催化下，形成可溶性形式LC3称为LC3-I，定位于胞浆中。之后，LC3-I在哺乳动物E1泛素样酶Atg7和E2泛素样酶Atg3的催化下，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合，称为LC3-II。14Atg12-结合和LC3-修饰两条泛素样修饰过程相互偶联。Atg10和Atg3两种E2样酶在调控autophagy上述两条泛素样修饰过程中发挥重要作用。Atg5是自噬的限速调控步骤，其过表达可增强自噬。Atg12泛素样结合位点赖氨酸130的突变可显著降低Atg5功能。LC3-II的形成依赖于Atg12-Atg5复合物：在Atg5-/-的胚胎干细胞或表达结合缺陷型Atg5基因（Atg5K130R）突变株的胚胎干细胞中，LC3-II是检测不到的。15Autophageinheartnostressbasallevelsmildstressenhancedseverestressexcessive/long-termupregulatedbeneficialbeneficialharmfulautophage1.maintainingcellularhomeostasis2.againstexcessordysfunctionalorganelles1.remodelingdamaged/harmfulorganelles2.recyclingmacromoleculesmaintainenergylevelsproteinsynthesis1.excessiveself-digestionofessentialorganellesandproteinssurvivaldeathheartfateactionnormal3.自噬过程的信号调控171.mTOR（MammalianTargetofRapamycin）信号途径TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子，并发挥“门卫（gatekeeper）”作用。哺乳动物细胞中的核糖体蛋白质S6(p70S6)抑制自噬的发生，它位于TOR信号途径下游，活性受mTOR调节。Rapamycin通过抑制mTOR的活性，发挥抑制p70S6活性，诱导自噬发生的作用。182.ClassⅠPI3K/PKB途径ClassⅠPI3K是自噬的负调节分子，它可磷酸化PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2，生成PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P3，然后结合Akt/PKB和它的活化分子PDK1,抑制自噬的发生。结节性硬化复合物1(TSC1)和TSC2蛋白位于Ⅰ型PI3K/PKB途径的下游，可通过抑制小G蛋白Rheb，抑制TOR激酶的活性，对自噬发挥正向调节作用。PTEN磷酸酶也是自噬的正向调节分子，它使PtdIns(3,4,5)P3去磷酸化，从而解除Ⅰ型PI3K/PKB途径对自噬的抑制。193.Gαi3蛋白和氨基酸GTP结合的G蛋白亚基Gαi3是自噬的抑制因子，而GDP结合的Gαi3蛋白则是自噬的活化因子。GAIP作为RGS家族成员之一，通过Gαi3蛋白加速GTP的水解，促进自噬的发生。AGS3也能正向调控自噬效应。氨基酸作为自噬过程蛋白降解物的终产物，可负性反馈调节自噬。外源性氨基酸的去除，可以阻断TOR信号途径，而自噬产生的内源性氨基酸可补足氨基酸缺陷，恢复TOR信号转导。204.其他激素在自噬的调控中也起重要作用。胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素则促进自噬。酪氨酸激酶受体、PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium也存在于自噬过程错综复杂的调控网络中，但其机制还不甚清楚。21AutophageSignalingAMPK通路自噬与凋亡通路的交联自噬过程研究方法231．形态学方法电子显微镜迄今为止，电子显微镜是研究autophagy的唯一可信赖方法。通过电镜可对细胞的自噬活性进行定量，自噬泡占胞浆总面积或体积的比例是目前通过电镜对细胞自噬活性进行定量的唯一方法。Monodansylcadaverine(MDC)染色MDC是一种荧光染料，被用作自噬泡的示踪剂。可与GFP-LC3及溶酶体标记物共定位。242．Autophagy的特异标志物GFP-LC3定位LC3-I到LC3-II的转化Beclin1的表达253．Autophagy特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）3-MA是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断自噬泡与溶酶体的融合，被广泛用作Autophagy的抑制剂Rapamycin（自噬促进剂）CompoundC（AMPK抑制剂）其他渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002和巴佛洛霉素A1(BafilomycinA1)等谢谢！