辅助生殖临床及实验室人员工作规范

第一部分体外受精—胚胎移植及其衍生技术临床操作规程第一节不孕症的诊断一对夫妇在没有采取避孕措施的情况下，有规律性生活1年而未能自然妊娠，即诊断为不孕症（WHO，1995）。首诊时详细询问并记录患者的不孕时间、既往性生活史、既往妊娠史、既往检查及结果、遗传病史、家族史，了解患者是否可能暴露于毒性物质,夫妇双方有无酗酒、吸烟、非处方镇静剂的使用、吸毒等，详细询问可能影响生育能力的疾病史，包括糖尿病、内分泌疾病、自身免疫性疾病，了解月经周期、经量、经期、是否痛经等，询问患者性生活的频率,了解有无性功能障碍，并根据情况建议不孕症夫妇接受以下检查,以明确不孕症病因。1、女方因素（1）月经第2~5天，抽血检查性激素水平：FSH、LH、E2、PRL、T。（2）月经干净3~7天，输卵管碘油造影检查或腹腔镜检查。（3）阴道B超自然周期排卵监测，至卵泡破裂。（4）黄体中期（监测排卵后1周）抽血检查孕激素水平。（5）必要时宫腔镜检查了解子宫腔内病变。（6）抗精子抗体。2、男方因素（1）精液常规分析，结果异常需复查1~2次（2）按Kruger严格形态标准进行精子形态分析（3）连续3次精液离心检查均未发现精子者建议行以下检查：经直肠精囊、前列腺彩超（TURS）染色体核型分析性激素：FSHLHTPRLE2睾丸/附睾穿刺，了解睾丸/附睾中是否有成熟活动精子（4）抗精子抗体-2-第二节体外受精与胚胎移植的适应症与禁忌症一、体外受精与胚胎移植的适应症：1、女方各种因素导致的配子运输障碍。2、排卵障碍。3、子宫内膜异位症。4、男方少、弱精子症。5、不明原因的不育。6、免疫性不孕。二、体外受精与胚胎移植禁忌症：（1）如有下列情况之一者，不得实施体外受精-胚胎移植及其衍生技术①男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病；②患有《母婴保健法》规定的不宜生育的、目前无法进行胚胎植入前遗传学诊断的遗传性疾病；③任何一方具有吸毒等严重不良嗜好；④任何一方接触致畸量射线、毒物、药物并处于作用期；（2）女方子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。第三节体外受精与胚胎移植助孕前常规检查1、全身体格检查：血压、脉搏、身高、体重（BMI）、皮肤粘膜、心脏、肺脏、乳房、肝脏、脾脏、肾脏、脊柱、四肢等。2、女性生殖系统检查：有无生殖道畸形、分泌物异常，宫颈有无糜烂，子宫大小、质地、位置、活动度，附件有无包块及其大小。3、实验室检查：女方检查项目男方检查项目血常规血型（ABORh）尿常规血型（ABORh）白带常规细胞涂片或阴道镜精液常规支原体衣原体淋球菌支原体衣原体淋球菌-3-乙肝系列丙肝抗体乙肝系列丙肝抗体HIVTPHIVTP血清抗精子抗体抗子宫内膜抗体抗心磷脂抗体血清抗精子抗体肝功肾功血糖血沉生殖激素测定凝血功能病毒四项子宫输卵管通液或造影血基础性激素测定（月经第2~5天）根据患者年龄或病史确定是否需要取子宫内膜检查必要时行宫、腹腔镜检查本院及院外二级以上医院检查结果一年之内有效第四节控制性超排卵（COH）1、治疗开始之前应向夫妇双方详细解释治疗的全过程、治疗方法及可能发生的并发症，包括可能出现的女方对超促排卵无反应、卵巢过度刺激等导致的治疗失败，并征得夫妻双方知情同意。2、常用的促排卵药物有：促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）、纯卵泡刺激素（FSH-HP）或重组人卵泡刺激素（r-FSH）、人绝经期尿促性腺激素（HMG）以及绒毛膜促性腺激素（HCG）等。以下为几种常用的超排卵方案：长方案、短方案、超短方案、超长方案或联用口服避孕药等方案。但应注意的是促超排卵方案并非是一成不变的,实际操作中应根据患者的具体情况对各种药物的使用及剂量加以调整已实现治疗方案的个体化.（1）长方案：于治疗前一周期的黄体中期（周期第21天或排卵后的5~7天）,B超检查了解子宫和双卵巢情况，若子宫内膜呈C型，卵巢见排卵征象，抽血查P值为15~30ng/ml,肌肉注射长效GnRH-a1.25mg~1.875mg一次，或短效GnRH-a0.1mg隔日一次，启动日改0.05mg每日一次至HCG日，Gn从月经周期的第3~7天开始注射。（2）超长方案：于月经周期的第2天使用长效GnRH-a3.75mg/28天3~6个疗程,于末次注射GnRH-a的第15天开始监测血E2，当E2升至10~30pg/ml，窦卵泡直径5~10mm,子宫内膜厚度≤5mm时开始注射Gn。-4-（3）短方案：于治疗周期月经的第2天开始注射GnRH-a0.1mg/天至HCG日，Gn从月经周期的第3天开始注射。（4）超短方案：月经周期的第2~7天应用GnRH-a0.1mg/天，月经周期的第3天开始注射Gn。（5）OC＋GnRH-a重叠方案：患者自自发月经或激素撤退性出血第3~5天开始口服OC，连续服用25天，第21天开始给予GnRH-a，下次月经第3~7天开始给予Gn。3、当使用GnRH-a一周后至Gn启动之前，若阴道B超发现单/双侧卵巢有单纯性囊肿，直径＞1cm且＜5cm时，需要在严格消毒下行阴道穿刺抽出囊肿液送病理科检查，若无异常，方可继续方案。4、于下一月经周期第3天阴道B超及血清激素检查，达到以下标准：双侧卵巢卵泡直径均≤10mm,血LH≤5miu/ml,E2＜60pg/ml,子宫内膜厚度≤5mm为垂体降调节，予以Gn启动（通常为月经的第3-7天）。5、建议非卵巢因素患者Gn常规启动的剂量为：＜30岁150IU,≥30岁225IU,并根据患者卵巢储备情况及BMI对超排卵方案包括使用药物的类型、剂量、使用时间等作具体的调整。（卵巢储备根据患者年龄、基础FSH、E2值、基础状态卵巢体积及窦卵泡数目，有无卵巢输卵管病变手术及严重的盆腔粘连等评估）。6、超出常规启动剂量的促排卵方案建议在以下病人使用：以前的治疗显示病人对超排卵治疗反应不良，2次以上卵泡早期的血FSH水平＞12miu/ml或高于正常参考值2个标准差，年龄大于38岁。7、各种方案的超排过程中，若发育成熟的卵泡（直径≥14㎜）＜2~5个，血清E2值水平仍＜300~600pg/ml为卵巢低反应。应让患者知情，是否取消本次IVF-ET治疗周期由患者决定。8、当使用Gn7天后测血E2，以评价卵巢反应，B超监测双卵巢主导卵泡直径＞14mm时需动态监测血、尿LH、E2、P、。9、排卵监测方法包括：阴道B超、血和尿激素水平测定、宫颈粘液评分等。10、当至少2个优势卵泡直径达17~18mm,注射HCG5000~10000IU,34~36小时取卵。11、注射HCG日评价子宫内膜厚度、类型。子宫内膜的测量：取子宫纵切面，清晰显示内膜，从一侧内膜、子宫肌层交界处垂直于子宫纵轴测量至对侧内膜、肌层交接-5-处。分型标准：A型内膜呈清晰“三线征”；B型三线征欠清晰；C型内膜呈团块状，回声增强，三线征消失。当子宫内膜厚度≥7mm，提示子宫内膜发育正常。12、COH取消周期指征（1）早发LH峰或隐匿LH峰卵泡直径大于14mm,定期检测血清LH、E2、P水平及尿LH定性检测。当出现尿LH峰或血LH＞10miu/ml,或较基础LH水平升高3倍以上,伴随P水平逐步升高(＞3ng/ml),可诊断早发LH峰或隐匿LH峰,处理选择：①取消周期；②立即注射HCG，30小时后取卵；③继续完成COH周期，胚胎移植时选择部分优质胚胎冷冻保存，待以后行FET。（2）反应不良各种COH方案中，若注射Gn7天以上，双卵巢无卵泡发育，增加Gn剂量2~3天后卵巢仍无反应或生长卵泡数≤2~5个，为卵巢低反应，应让患者知情并决定是否取消COH周期。（3）子宫内膜因素注射HCG日，B超检查提示子宫内膜厚度＜6mm，建议取消该周期胚胎移植，冷冻胚胎，待以后行FET。第五节卵子采集1、采卵手术时间：注射HCG后34~36小时。2、术前准备：术前15分钟肌肉注射度冷丁50~100mg，排空膀胱，患者取膀胱截石位，无菌生理盐水冲洗外阴、阴道，并冲洗干净手套及B超套上的滑石粉。3、手术经过：全过程按手术要求无菌操作。阴道B超确认双侧卵巢位置，卵泡数目及大小，注意周围大血管的分布。显示欲穿刺卵泡的最大切面，沿针导置入穿刺针，缓慢穿入阴道壁，加90~100mmHg负压后迅速刺入目标卵泡中央，同时快速回旋和小范围（约5mm）来回抽动穿刺针，直至目标卵泡完全塌陷。尽量穿刺所有的卵泡；位于同一穿刺线上的卵泡可自浅至深一次进针完成，对不同穿刺线上的卵泡，退针至卵巢表面（不退出阴道壁），改变穿刺针方向再行穿刺，进针前或出针后以缓冲液冲洗针管；一侧穿刺结束后再穿刺另侧。-6-4、阴道B超引导下取卵术的注意事项：（1）尽量快速而稳固的穿刺入卵巢，有助于固定卵巢。（2）尽量减少穿刺次数，力争每侧卵巢一次穿刺结束。（3）手术中的负压应保持在90~100mmHg。（4）穿刺前转动阴道探头，充分暴露所显示的卵泡，注意和盆腔血管鉴别，通过转动探头，可以发现血管由“卵泡样”回声转变为长管状的回声。（5）卵巢非赘生性囊肿、输卵管积液与卵巢巧克力囊肿均应在取卵完成后再行穿刺。如在取卵过程中穿刺经过巧克力囊肿，应立即更换穿刺针及试管。（6）直径≥14mm的卵泡数≤6个时，建议使用双腔穿刺针，通过冲洗卵泡，避免丢失卵子。5、术毕常规扫描盆腔，检查有否可能的内出血如血肿形成，手术结束后拭净阴道积血，检查阴道穿刺点，发现活动性出血用宫颈钳钳夹出血点并以纱布压迫，记录纱布数量，两小时后取出。注意患者一般情况，观察两小时，经手术医生检查无异常后方可离院。并嘱ET前禁性生活。第六节单精子卵胞浆内注射（ICSI）卵母细胞胞浆内单精子注射是利用显微操作技术将单个精子直接注入卵母细胞胞浆内以建立妊娠的技术。1、ICSI指征：（1）严重的少、弱、畸精子症。（2）不可逆的梗阻性无精子症。（3）生精功能障碍(排除遗传缺陷疾病所致)。（4）免疫性不育。（5）体外受精失败。（6）精子顶体异常。2、治疗前检查：（1）同常规体外受精与胚胎移植。（2）男方检查：内分泌检查FSH、LH、T，染色体核型检查，无精子症者行睾丸-7-或附睾穿刺抽吸检查及病理检查。（3）无精子症的患者需睾丸或附睾穿刺活检证实存在活精子。（4）怀疑由遗传性因素引起的男性不育，应进行有关遗传检查。3、技术过程及注意事项：（1）同常规体外受精与胚胎移植。（2）必要时行附睾、睾丸穿刺取精技术。（3）需要熟练的辅助生育显微操作技术：按要求准备精子和去除颗粒细胞的卵子，在显微镜下先将视野调至含有精子的液面的边缘，选择一条活动的、形态正常的精子，将注射针稍稍调高，垂直放于活动精子尾部的中点，慢慢下压，随即将注射针快速划过精子尾部，精子被制动。被制动的精子先尾后头吸入注射针内，然后将显微注射针转至有卵子的液滴。用显微固定针固定卵子，将显微注射针与卵子均调节至最清晰状态，注射针位于卵子的正中部位，卵子的极体部位于11～12点位置或6～7点位置。将精子推至注射针尖端处，注射针于3点位置垂直穿过透明带及卵子胞浆膜进入胞浆内，回吸部分胞浆至胞浆膜破裂，然后将回吸的胞浆同精子及尽量少的PVP一起小心地注入胞浆，最后撤出注射针，精子留在胞浆内。受精后16～19小时观察原核并更换培养液。4、ICSI治疗的安全性与存在问题用正常精液进行IVF与ICSI的妊娠率无显著差异，但ICSI是侵入性治疗，所以仅限于有必要者。ICSI帮助了少、弱、畸精子的受精。但是，已经证实一些遗传性的基因缺陷可导致少、弱精，本来在自然受精过程中被淘汰的遗传缺陷可通过ICSI传递到下一代。此外，注射操作也可能导致卵母细胞未知的损伤。因此，对ICSI治疗后的妊娠，应加强孕期和产后的随诊。第七节胚胎移植与黄体支持1、胚胎移植：（1）胚胎移植时间：取卵后48小时或72小时（细胞期胚胎）进行胚胎移植。移植步骤：手术前嘱患者充盈膀胱，待觉有尿意后进入移植室，B超了解膀胱充盈程度及子宫位置，当子宫显影满意后，患者取膀胱截石位，覆以无菌孔巾，按手术要求-8-无菌操作，动作轻柔以免刺激宫颈子宫等，窥器充分暴露宫颈，拭净阴道及宫颈分泌物，再以培养液拭净宫颈口。B超下置胚胎移植管外套于宫颈