DBS22 010-2013 食品安全地方标准鲜(冻)畜肉中鸭源性成分的定性检测 PCR方法

DBS22吉林省地方标准DBS22/010—2013食品安全地方标准鲜(冻)畜肉中鸭源性成分的定性检测PCR方法2013-10-08发布2013-10-08实施吉林省卫生厅发布DBS22/010—2013I前言本标准的附录A为资料性附录。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学。本标准主要起草人：史艳宇，刘金华，邴炜，华蕾，王莹，金哲勇，张庆波，吕航，赵立群。DBS22/010—20131食品安全地方标准鲜(冻)畜肉中鸭源性成分的定性检测PCR方法1范围本方法规定了鲜（冻）畜肉中鸭源性成分的PCR定性分析方法。本方法适用于生鲜、冷冻畜肉中鸭源性成分定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义鸭源性成分duck-derivedmaterials鸭种属特异性DNA片段。4原理对样品进行DNA提取，通过PCR扩增，检测鸭特异性基因片段。5试剂和材料除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1鸭源性成分检测用引物（对）序列为：上游引物：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’下游引物：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’5.2TaqDNA聚合酶。5.3限制性内切酶：StuI酶。5.4dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。5.5食物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.6分子量标记：100bp~3000bpDNAMarker。DBS22/010—201325.7CTAB裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/LTris-HCl（pH8.0）[Tris-：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷]，0.7mol/LNaCl，0.01mol/LEDTA（pH8.0）(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)。5.8CTAB沉淀液：CTAB5g/L，氯化钠0.04mol/L，pH8.0，高压灭菌。5.9氯化钠溶液：1.2mol/L。5.10蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水溶解为20mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.11三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等有机试剂。5.1210×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.13琼脂糖：电泳纯。5.14电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。5.15溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。5.16加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液。5.17酶切缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH7.5），10mmol/LMgCl2，50mmol/LNaCl，0.1mg/mLBSA。6仪器和设备6.1PCR仪。6.2生物安全柜。6.3恒温水浴锅。6.4离心机：转速≥12000r/min。6.5移液器：0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、200μL~1000μL。6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7电泳仪。6.8凝胶成像系统。6.9搅碎机。6.10pH计。6.11天平：感量0.01g。6.12振荡器。6.13冰箱：-20℃～2℃。6.14高压灭菌器。6.15干热灭菌器。6.16离心管：1.5mL、2mL。7采样7.1采样工具下列采样工具应经160℃±2℃，2h高温灭菌：剪刀、镊子、钎子。7.2样品采集与储运DBS22/010—20133待检样品装入一次性密闭的塑料袋内或其他清洁容器（一个采样点的样品放入一个塑料袋或容器），编号，冷藏保存和运输。7.3试样制备与保存生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于500g作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20℃冷冻保存。8检测步骤8.1DNA提取和纯化8.1.1CTAB法称取500mg待检试料于2mL离心管中，加入1mLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K溶液，65℃温育1h，期间震荡混匀3~5次，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时，再加入适量CTAB裂解液；12000r/min离心5min，取1mL上清于2mL离心管中，加700μL三氯甲烷，漩涡震荡30s，12000r/min离心10min，收集600μL~650μL上清液到新的2mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温60min；12000r/min离心5min，去除上清液，加350μL氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，漩涡震荡30s，12000r/min离心10min，转移上清液到新的离心管。加0.8倍体积异丙醇，室温20min，12000r/min离心10min，加500μL70%乙醇水溶液，漩涡震荡30s，12000r/min离心10min，去除上清液，室温条件下过夜或者60℃烘15min~25min，注意不要让沉淀过干。加50μL去离子水溶解沉淀，-20℃保存。8.1.2试剂盒法采用商品化的食品基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。8.2DNA浓度和纯度的测定取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5~2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至约10ng/μL~50ng/μL。501000ANc.........................................................................(1)式中：c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。8.3PCR检测8.3.1PCR反应体系PCR反应体系见表1。每个样品设置2个平行。DBS22/010—20134表1PCR反应体系试剂加入量（μL）10×PCR缓冲液2.5dNTP溶液(10mmol/L)0.5TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2上游引物(10μmol/L)1.0下游引物(10μmol/L)1.0DNA模板（50ng/μL)2.0补水至258.3.2PCR扩增条件94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检测过程中设置核酸提取空白对照、PCR扩增空白对照、PCR扩增阴性对照、PCR扩增阳性对照。用已知含有鸭源性成分的样品作阳性对照，用已知不含有鸭源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。8.3.3PCR扩增产物电泳检测取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5µL~8μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，用100bpDNAMarker作参照。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8.3.4限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应或进行测序（序列参考附录A）。酶切反应体系（20μL）：StuI酶2U，酶切缓冲液2μL，加入PCR扩增产物至总体积20μL。酶切在37℃下进行，20min。酶切完成后电泳，方法见8.3.3。9结果判断与表述9.1PCR扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为201bp（序列参考附录A）。9.2限制性内切酶酶切结果阳性样品PCR产物采用内切酶StuI酶切后，酶切片段大小为118bp和83bp。9.3结果表述PCR产物为阳性，同时酶切结果正确者判为含有鸭源性成分，表述为检出鸭源性成分；PCR产物为阴性者判定不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。DBS22/010—2013510检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物无害化处理。DBS22/010—20136AA附录A（资料性附录）PCR产物测序结果CATCTATCCTGCTAGCCGCCGGCCTCTTATCAATGCTCCTAGTGATACTCCAATGATGACGGGACATTGTCCGAGAGAGCACCTTCCAAGGCCACCACACACCTACAGTCCAAAAAGGCCTACGATACGGCATAATCCTCTTCATCACATCCGAAGCTTTCTTCTTCCTAGGATTTTTCTGGGCATTCTTCCACTCAAGCC_________________________________