DB51 T 614-2006 马铃薯癌肿病检验鉴定技术规程

ICS备案号：DB51四川省地方标准DB51/T614—2006马铃薯癌肿病检验鉴定技术规程RuleofDetectionMethodforSynchytriumendobioticum(Schilberszky)Percival2006-08-04发布2006-08-15实施四川省质量技术监督局发布211DB51/T614—2006I目次前言................................................................................2121范围..............................................................................2132规范性引用文件....................................................................2133术语和定义........................................................................2134取样方法..........................................................................2145仪器及用具........................................................................2146试剂..............................................................................2147检验鉴定..........................................................................2148结果判定..........................................................................2159样品保存与处理....................................................................215DB51/T614—2006212前言本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准主要起草人：吴志平、宁红、郭迪金、陈素清、熊玉兰、帅波。DB51/T614—2006213马铃薯癌肿病检验鉴定技术规程1范围本标准规定了马铃薯癌肿病检验取样、检验鉴定及样品保存与处理的技术要求。本标准适用于马铃薯癌肿病的检验和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB7331《马铃薯种薯产地检疫规程》GB15569《农业植物调运检疫规程》3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1马铃薯癌肿病Potatowartdisease由Synchytriumendobioticum(Schulb.)Percival侵染马铃薯引起的一种真菌性病害。病原菌属壶菌门（Chytridiomycota），鞭毛菌亚门（Mastigomycotina），壶菌纲（Chytridiomycetes），壶菌目（Chytridiales），集壶菌科（Synchyrtiacese），集壶菌属（Synchytrium），内生集壶菌（endobioticum）。3.2癌瘤cancerendobioticum马铃薯癌肿病的典型症状，是由马铃薯癌肿病菌侵入寄主后，刺激寄主细胞组织增生而形成的大小不一的肿瘤。3.3营养体vegetalbody指马铃薯癌肿病菌在整个侵染循环中营养生长阶段所形成的菌体结构，含游动孢子、夏孢子囊堆及夏孢子囊。3.4繁殖体propagule指马铃薯癌肿病菌由营养体经有性繁殖而产生的菌体结构，含接合子和休眠孢子囊。3.5游动孢子Planospore当环境条件适合时，由马铃薯癌肿病菌休眠孢子囊或夏孢子囊萌发而产生。3.6夏孢子囊及夏孢子囊堆summersporangium﹠summersporangiosorus马铃薯癌肿病菌游动孢子侵入寄主组织细胞内，使寄主细胞受刺激而膨大，菌体细胞经多次分裂，形成夏孢子囊堆，夏孢子囊堆内含物进一步发育形成多个夏孢子囊。3.7结合子zygote当环境条件不适合时，马铃薯癌肿病菌游动孢子形成配子，并结合形成结合子。3.8休眠孢子囊restingsporangium在不良环境条件下，马铃薯癌肿病菌接合子侵入寄主表皮细胞发育而成的有性菌体结构。DB51/T614—20062144取样方法4.1取样时间产地检疫取样时间可在齐苗至收获时进行；调运检疫和土壤取样时间可根据工作需要确定。4.2产地检疫取样4.2.1植株地上部典型症状取样方法植株有马铃薯癌肿病典型症状或疑似症状，整株取样。4.2.2植株地上部无典型症状取样方法植株无马铃薯癌肿病症状，田间对角线5点取样，每点取5窝薯块，共取25窝。4.3调运检疫取样4.3.1贮存期薯块取样方法在薯堆中检查薯块或打开包装物检查薯块，发现有马铃薯癌肿病典型症状或疑似症状的取薯块10个～20个；未发现马铃薯癌肿病症状，取样方法和数量参见GB15569《农业植物调运检疫规程》。4.3.2运输途中薯块取样方法薯块散装运输时，在薯堆中分上、中、下层检查薯块；薯块包装运输时，打开包装物检查薯块。发现有马铃薯癌肿病典型症状或疑似症状的取薯块10个～20个，未发现马铃薯癌肿病症状，取样方法和数量参见GB15569《农业植物调运检疫规程》。4.4田间土壤取样方法对角线5点取样，每点在5m2范围内挖取耕作层表土土壤约1000g，四分法制样后，取检验土样约500g送实验室备用。5仪器及用具生物显微镜、离心机、样筛、烧杯、培养皿、载玻片、盖玻片、吸管。6试剂除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用高压灭菌的无菌容器分装。6.10.1%升汞（HgCl2）称取升汞0.1g，用少许酒精溶解，再加蒸馏水至100mL。6.2四氯化碳（Cl4）。6.3乳酚油将苯酚结晶加热熔化后取20mL加入20mL乳酸中搅拌均匀，再先后加入20%甘油40mL和蒸馏水20mL搅拌均匀。7检验鉴定7.1检验鉴定原理马铃薯癌肿病菌引起植株所表现的主要症状特征是该病初步诊断的依据，病原菌在不同侵染时期的营养体和繁殖体形态特征是准确鉴定该病的依据，通过镜检该病原菌的营养体和繁殖体可对马铃薯癌肿病进行准确判定。7.2典型症状鉴定7.2.1植株地上部症状特征鉴定植株地上部症状特征描述参见GB7331《马铃薯种薯产地检疫规程》。7.2.2植株地下部症状鉴定DB51/T614—2006215植株地下部典型症状特征：——茎基部癌瘤呈花椰菜形，癌瘤生长中不断向周围发展，可包围整个茎基部，甚至露出土面。——匍匐茎癌瘤呈花椰菜形，有的癌瘤围绕匍匐茎生长，后期最易腐烂。——薯块癌瘤花椰菜形，癌瘤多从芽眼为中心产生，初为乳白色，后转为浅褐色，最后呈黑色且腐烂。癌瘤质地粗糙、疏松，感病早的薯块多发育成畸形。7.3实验室检验7.3.1植物组织检验7.3.1.1切片法检验取癌瘤或茎基部寄主组织、薯块芽眼及周围组织切片镜检，检查是否有夏孢子囊堆、夏孢子囊或休眠孢子囊，还可继续将夏孢子囊和休眠孢子囊放在有蒸馏水的玻片上，加盖玻片静置30min，镜检是否从孢子囊破裂处释放出游动孢子。夏孢子囊及夏孢子、休眠孢子囊和游动孢子的形态特征见附录A。7.3.1.2染色法检验染色法镜检游动孢子和接合子，方法参见GB7331《马铃薯种薯产地检疫规程》。游动孢子和接合子的形态特征见附录A。7.3.2土壤检验7.3.2.1洗涤法每1000g薯块用水400mL洗下表面泥土，将泥水静置沉淀30min，用吸管吸取上清液倒入离心管，离心10min(3000r/min)，倒去上层清液，镜检沉淀物中是否存在休眠孢子囊。7.3.2.2四氯化碳-乳酚油漂浮法将已风干、研细、过筛的土样称取1.5g～2.0g，倒入试管内，加四氯化碳8ml，充分搅拌，静置2min～3min，让土壤颗粒等杂质沉降，休眠孢子悬浮在四氯化碳液中，将悬浮液倒入另一个试管中，加入乳酚油2ml，充分搅拌、静置，使之分层，用移液管吸取上层乳酚油孢子囊悬浮液0.1ml，制片镜检。8结果判定凡具备本标准7.2典型症状特征之一的，可初步诊断为马铃薯癌肿病，需送实验室检验确诊；凡在本标准7.3.1、7.3.2.1检验中发现病原菌的夏孢子囊堆、夏孢子囊、休眠孢子囊、游动孢子和接合子，可判定寄主感染了马铃薯癌肿病菌；根据7.3.2.2检验中若镜检发现休眠孢子囊，可判定土壤中含马铃薯癌肿病菌。9样品保存与处理样品需作为标本保存的，制作成浸制标本或玻片标本，妥善保存。其余样品用煮沸、焚烧等方式，进行灭活处理。DB51/T614—2006216附录A（规范性附录）马铃薯癌肿病菌菌体形态特征A.1游动孢子游动孢子由休眠孢子囊或夏孢子囊萌发而产生，是马铃薯癌肿病菌的无性营养体，单核，后端有一根尾鞭，在土壤水中可移动，遇到适合的寄主，侵入寄主的芽眼或其他幼嫩部分的表皮细胞而造成为害。在寄主生长期间，可以游动孢子形态反复侵染寄主。A.2夏孢子囊堆夏孢囊堆外壁橙色，内壁无色，卵形或球形，大小47μm～72μm×81μm～100μm，薄壁。每个夏孢子囊堆含有3～9个（通常以3～5个为多）夏孢子囊。A.3夏孢子囊由夏孢子囊堆的内含物发育而成，卵形或多角形。夏孢子囊壁薄色淡，大小25μm×62μm～38μm×87μm。夏孢子囊成熟后散发出游动孢子。A.4结合子当干旱或低温等环境条件不适合游动孢子再侵染时，游动孢子形成配子，并结合形成结合子。结合子双核双尾鞭，结合子侵入寄主细胞，发育为休眠孢子囊。A.5休眠孢子囊休眠孢子囊是一种有性菌体结构，单个产生于癌组织表层细胞内，锈褐色；近球形，直径25μm～75μm；壁厚4.1μm～10.5μm，分三层，内壁薄而无色，中壁光滑，金褐色，外壁厚呈褐色，外层有不规则的脊突。成熟休眠孢子囊内含有数百个游动孢子。