DB13T 1384.7-2011 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定

ICS65.120B46DB13河北省地方标准DB13/T1384.7—2011饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定Determinationofenrofloxacin/ciprofloxacin/norfloxacininfeed2011-05-10发布2011-05-20实施河北省质量技术监督局发布DB13/T1384.7—2011I前言本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、河北省医科大学、北京出入境检验检疫局技术中心、石家庄市疾病预防控制中心、河北省饲料产品质量监督检验站。本标准主要起草人：张岩、李挥、吕品、丛斌、卢小宇、张宏、范斌、贾茜、马春玲、米振杰、杨立学、李志平、沈磊、高振同、武英利。DB13/T1384.7—20111饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定1范围本标准规定了饲料中恩诺沙星，环丙沙星，诺氟沙星的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于饲料中恩诺沙星，环丙沙星，诺氟沙星的测定。本标准的方法检出限为10.0μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法（GB/T6682－2008，ISO3696:1987,MOD）。3方法提要试样加入内标后，氢氧化钠溶液提取，离子化的喹诺酮类药物经过阴离子交换固相萃取柱富集净化，用液相色谱-质谱/质谱法测定，梯度洗脱，内标法定量。4试剂与材料除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：HPLC级。4.2氢氧化钠。4.3甲酸（85％）。4.4阴离子交换柱（PAX）：60mg，3mL，或相当者。4.5同位素内标：氘代诺氟沙星，纯度≥98％。4.6恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准品：纯度≥99％。4.7恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准储备溶液：1mg/mL。准确称取适量的恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准品，甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。储备液储备在4℃冰箱中，可保存6个月。4.8恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准工作溶液：用甲醇－水（2＋8，体积比）分别配成浓度范围为1ng/mL～60ng/mL标准工作溶液，其中内标溶液浓度为50ng/mL，现配。4.9氘代诺氟沙星（NOR－D5）内标储备溶液：100µg/mL。称取适量的NOR－D5内标物（4.5），用甲醇（4.1）配成100µg/mL储备液，储备液储存在4℃冰箱中。4.10氘代诺氟沙星（NOR－D5）内标储备溶液：1µg/mL。取适量的内标储备液（4.8），用甲醇（4.1）稀释成100µg/mL储备液，内标工作溶液在4℃下保存。4.11氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：取4g氢氧化钠，溶解于1L水中。4.12甲酸-甲醇溶液（5＋95，体积比）：取5mL甲酸（4.3）于80mL水中，混合均匀。DB13/T1384.7—201125仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾粒子源。5.2分析天平：感量0.001g，0.1mg，各一台。5.3旋转蒸发仪。5.4固相萃取装置。5.5涡旋均混器。5.6真空泵：真空度不低于80kPa。5.7滤膜：有机系，0.45µm。5.8离心管：100mL，具塞。6试样的制备6.1提取准确称取5g样品（精确至0.01g），置于100mL离心管中，加经灼烧的无水硫酸钠，用干净玻璃棒将样品与无水硫酸钠搅拌分散均匀，准确加入1µg/mL内标溶液50µL，加入20mL氢氧化钠溶液，于涡旋均匀器上快速混匀。以5000r/min的速度离心5min，上清液移入125mL分液漏斗中，加20mL正己烷混合，涡漩振荡，静置分层，取下层水相待净化。6.2净化依次用3mL甲醇和3mL水活化固相萃取柱，将样品溶液转移到小柱上，依次用水、甲醇淋洗，弃去上述滤液。用甲酸-甲醇溶液3mL洗脱。40℃水浴旋转蒸发至干，用甲醇-水定容1.0mL,过0.45µm的滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。7测定步骤7.1测定7.1.1参考液相色谱条件色谱柱：C18，3µm，150mm×2.0mm(内径)或相当者。流动相：甲醇（A）+0.1%甲酸水溶液（B）。流速：0.20mL/min。梯度洗脱程序：参见表1。柱温：室温。进样量：25µL。DB13/T1384.7—20113表1梯度洗脱程序7.1.2参考质谱条件离子源：电喷雾离子源。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测。电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。定性离子对、定量离子对见表2。表2定性离子对、定量离子对恩诺沙星环丙沙星诺氟沙星氘代诺氟沙星定性离子对（m/z）360//316360/245332/231332/288320/276320/302325/281定量离子对（m/z）360/316332/231320/276325/2817.2定性定量7.2.1定性测定进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间和标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液质谱图相比，最大允许相对偏差不超过表3中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许相对偏差相对离子丰度〉50％〉20％～50％〉10％～20％≤10％允许的相对偏差±20％±25％±30％±50％7.2.2定量测定标准工作溶液在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准工作曲线（1ng/mL～60ng/mL），用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液响应值均在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，其相应的标准物质和内标离子流色谱图参见附录A。7.3空白实验除不加入试样外，按上述（7.1～7.3）步骤进行。时间（min）A（％）B（％）010902.0010904.0090108.0090109.00109015.001090DB13/T1384.7—201148结果计算结果按式（1）计算：MAmACSSXX××=…………………………………………..(1)式中:CX一一样品中喹诺酮的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）。AX一一样品中喹诺酮的封面积与相应内标峰面积比值。As——标准品中喹诺酮的峰面积与相应内标峰面积比值。ms一一喹诺酮的质量，单位为纳克（g）。m一一溶解残余物所得试样溶液体积，单位为毫升（mL）。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。DB13/T1384.7—20115AA附录A（资料性附录）MRM色谱图图A.1恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的MRM色谱图_________________________________