DB21T 1541-2007 农产品质量安全 北冬虫夏草代料瓶栽栽培技术规程

ICS备案号：辽宁省地方标准DB21DB21/T1541—2007农产品质量安全北冬虫夏草代料瓶栽栽培技术规程2007-07-01发布2007-08-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1541—2007I前言本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准起草单位：大连珍蕈生物技术开发中心、辽宁省农业科学院食用菌研究所。本标准起草人：陈平、苏君伟、孟昭武、邢瑛、黄磊、林文。DB21/T1541—20071农产品质量安全北冬虫夏草代料瓶栽培技术规程1范围本标准规定了北冬虫夏草代料栽培的产地环境、生产工艺、栽培技术管理、产品采收与包装等要求。本标准适用于利用广口瓶或罐头瓶作为代料基质的容器来培养北冬虫夏草的方法。不适用于虫体栽培方式。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB5749生活饮用水卫生标准GB/T14881食品企业通用卫生规范GB11680食品包装用纸卫生标准GB9693食品包装用聚丙烯树脂卫生标准GB9696食品包装用聚乙烯树脂卫生标准GB9683复合食品包装袋卫生标准GB9687食品包装聚乙烯成型品卫生标准NY/T391绿色食品产品环境技术条件3产地环境北冬虫夏草栽培产地环境应符合NY/T391要求。4生产工艺流程原料选择→培养料配置→装瓶（袋）→灭菌→冷却→接种→发菌期管理→转色管理→出草管理→加工→包装→储藏。5栽培技术管理5.1栽培季节北冬虫夏草出草适宜温度为10℃～22℃，辽宁地区每年4月～5月及9月～11月是北冬虫夏草出草最佳季节。如果有空调设备或利用条件好的防空洞则一年四季都可栽培。5.2品种选择及菌种生产5.2.1品种选择应选择符合国家《食用菌菌种管理办法》规定的优良品种，并经过栽培试验证明该品种纯正、菌丝生长健壮、浓密有力，菌龄短、无杂菌、色泽正，转色快、出草快、出草整齐为优良品种。如果不转色或转色较浅的菌株很难长出子座，即使出草，产量也很低。菌种在生产前必须转接活化，充分保证其纯度和较强的活力，发现菌丝体有倒伏现象，要进行复壮后再使用。5.2.2菌种生产根据不同生产季节，按NY528的要求，生产一级种（母种）及栽培用的菌种。DB21/T1541—200725.2.2.1固体菌种制作5.2.2.1.1培养基配方——配方Ⅰ：大米700g，玉米渣300g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，蚕蛹粉10g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，VB1少许；——配方Ⅱ：大米1000g，葡萄糖10g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g。5.2.2.1.2制备方法选任一配方,将药品溶于水中制成营养液.然后每瓶加入大米30g～32g,营养液30ml～35ml,用聚丙烯薄膜封口灭菌。采用常压灭菌100℃,维持时间8h～12h。采用高压蒸汽灭菌121℃～126℃，维持时间40min～60min。5.2.2.1.3固体菌种接种首先将环境、器具、工作服及人手做消毒处理。按照无菌操作将试管中的斜面菌种切割出一块迅速移入瓶（袋）内，然后封好瓶口或扎好袋口。一般每支斜面菌种可接4瓶～6瓶。摇动菌种块使其在培养基的料面上均匀滚过，这样发菌快，封面快。接种后把菌种瓶（袋）及时移入培养室的培养架上，贴上标签注明菌号与接种时间。5.2.2.2液体菌种制作5.2.2.2.1培养基配方——配方Ⅰ：玉米粉30g，黄豆饼粉20g，酵母粉10g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，蛋白胨0.5g，水1000ml，动物血液0.5%；——配方Ⅱ：马铃薯煮汁1000ml，蔗糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110ml，增产灵0.5mg——配方Ⅲ：蛋白胨10g，天门冬酰铵1g，甘油30g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，生长素1ml～5ml，水1000ml。5.2.2.2.2制备方法任选一配方,各组分经充分溶解后,在每个500ml容器瓶中(锥形瓶或罐头瓶)加入100ml～150ml溶液，然后分别用棉塞或聚丙烯薄膜封口。采用常压灭菌100℃，维持时间2h～4h。采用高压蒸汽灭菌121℃～126℃，维持时间20min～40min。5.2.2.2.3液体菌种接种在无菌条件下,从经过活化的斜面菌种中挑取4块-5块黄豆粒大小的带有菌丝体的培养基,接入已灭菌的液体培养基瓶内，贴上标签，注明菌号与接种时间，移到摇床上培养。5.2.3菌种培养5.2.3.1固体种培养5.2.3.1.1培养条件控制温度15℃～22℃，空气相对湿度50%～70%，室内保持黑暗。5.2.3.1.2定期检查在培养过程中的分别在第3天、第5天、第7天定期逐瓶检查，发现杂菌污染，即瓶内出现黑、红、绿等颜色或有异味、有积水，及时淘汰。5.2.3.1.3培养时间15d～20d菌丝长满，即可做原种或栽培种使用。5.2.3.1.4菌种鉴别菌丝初期洁白、粗壮，生长速率快，见光后容易分泌黄色色素，培养基表面气生菌丝较厚，即为正常菌种。5.2.3.2液体种培养根据生产规模采用不同的菌种制作方式。生产规模小，可采用固体菌种或摇瓶菌种。生产规模大，可采用深层发酵方式逐级扩大液体菌种的制作量，以满足生产的需要。DB21/T1541—200735.2.3.2.1培养条件在25℃±1℃条件下，摇瓶菌种在摇床上震荡培养，室内光线要暗。采用往复式震荡培养机，震荡频率在100次/min，如采用旋转式震荡机，则偏心距40mm，频率为150次/min。5.2.3.2.2定期检查接种后培养初期的第2天开始进行逐瓶目查，发现有菌液浑浊、菌丝迟迟不长或出现异味的即为污染菌瓶，随后在培养中期要抽样做平板培养和显微镜检查，以便及时发现有无细菌和霉菌的污染，观察菌丝活力。5.2.3.2.3培养时间培养5d～7d即为摇瓶菌种。5.2.3.2.4菌种鉴别菌液内布满北虫草菌球或菌片，菌液清亮，经纯度检查无杂菌污染，菌丝体重量达到一定比例（菌体重量g/液体积L）。5.2.3.3发酵罐培养菌种5.2.3.3.1培养方法将已培养好经镜检合格的摇瓶菌种，在无菌条件下注入装有小玻璃球的无菌瓶中，进行剧烈震荡（振动频率为200次/min）,把菌丝体打碎制成种子悬浮液。5.2.3.3.2扩繁接种按10%的接种量接入一级种子罐培养，在22℃±1℃条件下培养7d～10d，再由一级种子罐按10%接种量压入二级种子罐，于相同条件下培养7d～10d后再压入三级种子罐，同样条件下培养7d～10d。然后压入发酵罐培养，罐与罐之间的容积比呈10倍放大关系。5.2.3.3.3扩繁条件发酵罐培养一般采用自吸式发酵罐。要求罐温23℃～26℃，最适25℃±1℃；罐压0.4kg/㎝2～0.8kg/㎝2;通气量0.5V/v～0.8V/v;搅拌条件为50L罐40r/min～50r/min;500L罐120r/min～200r/min；1000L罐200r/min。培养7d～10d。5.2.3.3.4转罐及放罐标准逐级转罐和最后放罐之前，要求从培养罐内进行无菌取样，经镜检，菌种纯度、菌丝活力、菌丝体生长量都达到要求，才能作为菌种进行下一步培养。5.3栽培场地及菇室建造5.3.1栽培场地栽培北冬虫夏草的场所，应选择地势平坦、通风良好、水源充足、水质洁净、远离畜禽舍、无污染、环境清洁卫生的地方。5.3.2菇室建造栽培北冬虫夏草可利用空闲房屋、日光温室、或塑料大棚做栽培场所。为提高栽培场所利用率，可采用符合卫生要求的材料制作摆放栽培瓶的培养架。5.4原料选择、栽培容器及生产设备5.4.1原料选择栽培北冬虫夏草，主要用大米、玉米、小米、小麦、高粱米等可食用粮食作为原料。这些粮食的选择要特别注意无公害,符合无公害食品的标准，并要求新鲜、无虫蛀。5.4.2栽培容器栽培北冬虫夏草所需容器，有500ml或750ml广口瓶、罐头瓶、广口塑料瓶。5.4.3灭菌设备灭菌设备有两种：常压灭菌锅或高压灭菌锅。常压灭菌锅可自行建选,其构筑材料必须符合相应的安全卫生要求。高压灭菌设备必须从具有“压力容器生产许可证”单位购买。5.5栽培料配方与配制方法DB21/T1541—200745.5.1配方——配方Ⅰ:大米100%（适合东北产大米）；——配方Ⅱ:大米85%，玉米碴(15%)（适合东北产大米）；——配方Ⅲ:大米1000g,蛋白胨10g,多维葡萄糖5g,多维豆奶粉10g,磷酸二氢钾1.5g,硫酸镁0.75g,酵母膏5g,麸皮(煮汁)100g；——配方Ⅳ:大米800g,玉米渣200g,蔗糖20g,硫酸镁0.5g,氯化钠0.5g,酵母膏2g；——配方Ⅴ:大米900g,高粱米100g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁0.5g,酵母粉5g,蛋白质少量。5.5.2卫生要求、灭菌方法及配制方法5.5.2.1卫生要求上述配方任选其一，要求严格按配方配制，不许添加非配方成分；水质符合GB5749标准，场所和工具符合卫生要求，防止有害异物的混入。封口塑料膜应符合GB9693要求。5.5.2.2灭菌方法——采用常压灭菌：配制时采用500ml容器加入30g培养基后再加适量水，水量为培养基的1.5倍。采用750ml容器加入50g培养基后再加适量水，水量为培养基的1.5倍。——采用高压灭菌：配制时采用500ml容器加入30g培养基后再加适量水,水量为培养基的1.2倍。采用750ml容器内加入50g培养基后再加适量水,水量为培养基的1.2倍。5.5.3配制方法加水前先用食用碱将水的pH值调至7～8，用少许水将药物溶解后再装瓶，装瓶后用0.04mm～0.05mm的聚丙烯塑料膜封住瓶口,外套橡皮圈。为了在后期增加补光效果，一般不用低压聚乙烯膜封口。5.6灭菌与接种5.6.1灭菌5.6.1.1采用常压灭菌当温度达到100℃时,要保持10h，再焖锅6h。5.6.1.2采用高压灭菌当压力达到0.15mpa时,要保持1h，灭菌后的培养基不能呈糊状，基质要疏松，以利于菌丝生长。5.6.2接菌5.6.2.1接菌前的环境消毒接种室或接种箱在使用前要用空气净化器、紫外线或75%酒精消毒。超净工作台在使用前20分钟打开紫外灯杀菌；接种人员要穿干净的工作服，双手用75%的酒精棉球消毒；接种用具及菌种瓶表面用0.2%酒精溶液擦洗消毒，接种勺要在每换一个菌种瓶前都经灼烧灭菌；采用玻璃吸管接菌要预先包好与培养基同时灭菌，使用时每换一个菌种瓶就要更换一支吸管；接菌前还要准备好足够的经过杀菌处理的无菌水，接菌时采用三人一组进行操作，一人搬运，一人开盖、封盖，一人接菌。5.6.2.2固体菌种接种方法在酒精火焰旁，打开菌种瓶口，用接种勺或接种铲将一块蚕豆粒大小的菌种块迅速移入培养瓶内，封口。并摇动菌种块使其在培养基的料面上均匀滚过。然后贴标签，置于培养室。5.6.2.3采用摇瓶菌种接种培养好的摇瓶菌种应尽快使用，在1d～2d内使用完毕。以免长时间存放表面形成菌皮，菌种老化、活力降低，接菌过程要在无菌条件下进行，首先用无菌水将北冬虫夏草的液体菌种稀释3倍，然后进行接菌。接菌量为10ml,用接菌勺或吸管尽量把菌种均匀的撒在料面上，以促进发菌快、出草均匀。5.6.2.4采用发酵罐菌种要求有配套的液体菌种接种机及菌种的分装储运设备。液体菌种要求尽快使用，接菌后的栽培瓶要及时移入培养室，贴上标签，注明菌种编号、接菌日期。5.7发菌期管理5.7.1发菌环境DB21/T1541—20075菌瓶接完菌后，即进入菌丝培养阶段，又称发菌培养。在此阶段培养环境要求避光、通风、保温、控制湿度。培养室在使用前要彻底清扫，用紫外线、空气净化器或75%酒精进行消毒。5.7.2温度控制菌丝培养在6℃～30℃均可生长,5℃以下停止生长，适宜温度为15℃～25℃。当室温低于10℃时可采用电炉、暖气、土墙等适当的方法进行加温，接种后在18℃～20℃温度控制下经过24h，培养基表面形成无数的小星状菌落,4d～5d连片封面；液体种菌瓶6d～10d菌丝可布满培养基；固体菌种的菌瓶