DB21T 1861.4-2010 水产生物种质检验技术规程 简单重复序列扩增法

ICS 67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T1861.4—2010水产生物种质检验技术规程简单重复序列扩增法Simplesequencerepeatproceduretodetectgermplasmforaquaculturespecies2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1861.4  —2010I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：赫崇波、李宏俊、高祥刚、刘卫东、李云峰、鲍相渤。附录A为资料性附录。DB21/T1861.4  —20101水产生物种质检验技术规程简单重复序列扩增法1范围本标准规定了水产生物简单重复序列扩增法的术语定义、原理、试剂、仪器、取样、DNA提取、微卫星引物筛选、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶检测产物、数据统计和水产生物种质检验分析评价。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.15-2008养殖鱼类种质检验第15部分RAPD分析3术语定义下列术语定义适用于本标准。3.1简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR)又称为微卫星，一般指基因组中由短的重复单元(一般为1~6个碱基)组成的DNA串联重复序列。3.2聚合酶链式反应(PCR)一种分子生物学技术，指用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程，用于放大特定的DNA片段。3.3脱氧核苷酸(DNA)脱氧核苷的磷酸酯。如5′-脱氧腺苷酸(5′-dAMP)、5′-脱氧鸟苷酸(5′-dGMP)、5′-脱氧胞苷酸(5′-dCMT)DB21/T1861.4  —20102和5′-脱氧胸腺苷酸(5′-dTMP)，体内常为5′-磷酸酯。3.4等位基因（allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.5基因型（genotype）指特定座位的等位基因组成。3.6座位（locus）染色体上的位点。3.7等位基因频率（allelefrequency）给定座位上某等位基因所占的比例。3.8遗传杂合度（heterozygosity）表示群体在某个座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.9平均遗传杂合度（averageheterozygosity）表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.10多态信息含量（PIC）在连锁分析中一个遗传标记多态性可提供的信息量的度量。它是一个亲本为杂合子，另一亲本为不同基因型的概率。现常用来衡量座位多态性高低的程度。3.11遗传距离（geneticdistance）用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间DB21/T1861.4  —20103的亲缘关系将越远。遗传距离的计算方法有多种。3.12Nei氏遗传距离（Nei'sgeneticdistance）Nei提出的从大量基因频率数据估计每个座位的平均密码子差数的统计方法。3.13邻近结合法聚类分析（Neighborjoiningmethod，NJ）邻近结合法聚类分析（neighborjoining，简称NJ）是在系统进化分析时基于某个基因的序列进行分析，通过碱基的变化和差异计算相互之间的进化关系的一种计算方法。4原理微卫星中重复单位的数目存在高度差异，但是微卫星的侧翼通常都是保守的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列设计引物将微卫星位点扩增出来。由于微卫星位点重复单元数量的变异，不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这就是微卫星标记的原理。5试剂5.1裂解液按附录A配制5.2三羟甲基氨基甲烷饱和酚(Tris饱和酚)5.3三氯甲烷5.4异戊醇5.5无水乙醇5.6溴化乙锭5.710×Tris硼酸(10×TBE)电泳缓冲液按附录A配制5.86上样缓冲液5.9100bpDNA分子量标记5.10冰乙酸5.11琼脂糖5.12核苷酸(RNA)酶DB21/T1861.4  —201045.13蛋白酶K5.14丙烯酰胺5.15甲叉双丙烯酰胺5.16过硫酸铵5.17硝酸银（AgNO3）5.18N,N,N,N—四甲基乙二胺（TEMED）5.19无水碳酸钠5.20TaqDNA聚合酶5.21分子量标准(markers)5.22超纯水5.23硝酸5.24甲醛5.25乙二胺四乙酸(EDTA)5.26盐酸(HCl)仪器6.1凝胶成像分析系统6.2PCR仪6.3低温高速离心机6.5稳压稳流电泳仪6.7单道可调移液器6.8电子天平6.9水浴恒温震荡器6.10电泳槽6.11普通离心机6.12紫外分光光度计6.13超声波清洗器6.14超纯水器6取样7.1样品固定7.1.1Ⅰ型样品DB21/T1861.4  —20105将样品先用70%乙醇洗1次，再用超纯水冲洗2次，-20℃保存备用。7.1.2Ⅱ型样品从活体中直接采集肌肉或脏器组织，-20℃冰箱直接冻存。7.1.3Ⅲ型样品选取幼嫩藻尖，用毛笔在无菌海水中充分刷洗，解剖镜下观察，确定没有附生杂藻后，在无菌蒸馏水中清洗，晾干备用。8DNA提取8.1Ⅰ型样品在200μL离心管中放入1~4根毛发，毛囊置于离心管底部，剪去高于离心管部分的毛发，设置一个空白对照管；在每个离心管中加入15μL配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1×PCR缓冲液(50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl，0.01%明胶)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K20mg/L；在PCR仪上设置一个单循环程序：65℃30min，95℃15min，4℃10min；将上一步骤中的离心管放入预热好的PCR仪中，运行该程序。程序结束后，将离心管进行瞬时离心，-20℃保存备用。8.2Ⅱ型样品取-20℃下冻存的脏器0.2g，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，75mmol/LNaCl，0.5%SDS，5mmol/LEDTA)。振荡均匀后，65℃水浴1h；按GB/T18654.15-2008的规定，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用适当50µLTE缓冲液（10mmol/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA）溶解DNA，-20℃保存。8.3Ⅲ型样品取鲜样品50～150mg，剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品完全冷冻后，快速、用力研磨至粉末状；将研钵放入65℃水浴至样品粉末刚开始融化，向研钵中加入DNA提取液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，75mmol/LNaCl，0.5％SDS，5mmol/LEDTA)及RNA酶、蛋白酶K共400μL，用力碾磨30s。收集研磨好的组织匀浆移至1.5mL离心管中，65℃保温15~60min，按GBT18654.15-2008的方法，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；水相加入0.1倍体积醋酸钠(3mol/L，pH5.2)和两倍体积无水乙醇沉淀；溶于50µLTE缓冲液(10mmol/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA)，置-20℃保存备用。8.4DNA产物测定8.4.1DNA纯度检测吸取1~3µL提取的DNA，用浓度1~2％琼脂糖凝胶100V电泳30min，检测所提取DNA的质量。以DNA条带的分子量及有无拖尾为标准判断DNA的质量。8.4.2DNA浓度检测（1）紫外吸收定性测试分别于260nm波长和280nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260／A280比值在1.8~2.0范围内，方可正常进行后续实验。（2）紫外吸收定量测试DB21/T1861.4  —20106260nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值，根据公式(1)计算DNA浓度。DNA浓度(μg/mL)=[A260／(0.020×L)]×稀释倍数…………………………(1)式中：A260－被测样品在260nm下的吸光度值L－比色池厚度，单位cm。（3）基因组DNA完成定量测试后，稀释到50ng/µL备用。9微卫星引物筛选9.1微卫星引物的设计9.1.1根据已有序列设计引物利用GenBank上的已注册的物种的微卫星序列，参照引物设计的原则，用Primerpremier5.0进行引物设计。9.1.2利用文献中已公开的引物10PCR扩增10.1PCR反应体系PCR反应体积均为25L，按表1配制PCR反应体系。表1微卫星标记—PCR反应体系试剂反应体系PCRBuffer(10)2.5LMgCl2(25mmol/L)2L正向引物(2pmol/μL)0.5L反向引物(2pmol/μL)0.5LdNTPs(25mmol/L)0.5LrTaq(5U/L)0.2LDNA(50ng-100ng)3L超纯水16.8L10.2PCR反应程序按表2设置程序进行PCR反应。表2微卫星标记—PCR反应程序阶段温度时间194oC5minDB21/T1861.4  —2010794oC30–60s50–62oC30–60s72oC30–60s235个循环372oC10min44oC保存11聚丙烯酰胺凝胶检测PCR产物11.1聚丙烯酰胺凝胶凝胶的制备11.1.1制胶装置的准备弹簧夹、干胶架、胶板和隔板、手套、鲨鱼齿梳子、隔板、烧杯和搅棒。11.1.2胶板的按置（1）用KOH或乙醇清洗玻板上的污渍（2）用温的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，用自来水彻底冲洗，再用去离子水洗净。用乙醇冲洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干（必须洗净玻璃板，以确保灌胶时不会产生气泡）。（3）把大块玻璃板放在空的试管架上，把隔片放在玻璃板的两边。（4）再将较小（或带凹口）的玻璃板在间隔片上放置妥当，对齐隔片。（5）用弹簧夹将三边夹住，用琼脂糖胶液封好边。（6）将梳子放在胶模的敞开端并检查是否贴切适合，取出梳子将空胶模放在实验桌上。11.1.3制胶（1）在桌上放好空胶模。（2）将按附录A配制的30ml8%凝胶储存液中加入80μL过硫酸铵，20μLTEMED，用搅棒混匀溶液（不得有气泡），将胶模放在架片成45度角，然后用玻棒引流缓缓灌入溶液。缓缓灌入胶模中。（3）立即将鲨鱼梳子的平整侧插入凝胶溶液中，梳子两端插入面应等同。（4）平放在实验桌上，等其聚合完毕后，可立即使用或保存于室温达24h。11.1.4装备装胶（1）慢慢地从凝胶上移走梳子和弹簧夹以及底部的隔片，将胶板装到电泳槽上，用弹簧夹夹紧胶模。（2）用合适缓冲液把电泳槽的上下槽加满，用注射器冲洗胶的顶部。（3）将电极与电泳装置相连，在150–170V的恒定电压下预电泳20min。11.2点样DB21/T1861.4  —2010811.2.1吸取5μL扩增产物与5μL变性缓冲液混合；11.2.2放入PCR仪变性：98oC，8min，拿出后冰浴；11.2.3切断电泳槽电源，将已变性的样品扩增产样和变性缓冲液按1:2混合，用专门的点样移液器点入凝胶样品槽中。当所有的样品加完后，在预留的样品槽加点入100bpmarkers，将电源连接，300V恒压电泳。11.3凝胶的分离、标识与固定标识操作规程11.3.1关闭电源开关当指示剂跑到胶板2/3位置时，结束电泳。将电源电压调至为“O”，接着再关闭电源开关，切忌直接关闭电源开关，烧坏电泳仪。然后收集电泳缓冲液以备下次重用。11.3.2凝胶的标记将粘着聚