NYT 2050-2011 玉米霜霉病菌检疫检测与鉴定方法

ICS65.02fJB15中华人民共和国农业行业标准NY/T2050—2011玉米霜霉病菌检疫检测与鉴定方法DetectionandidentificationofPeronosclerosporaspp.2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T2050—2011前言本标准按照GB／T1.1——2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、广西壮族自治区植保总站。本标准主要起草人：王福祥、王凯学、覃贵亮、吴志红、邓铁军、李潇楠、李菁、沈昆、朱莉。ⅠNY/T2050—2011玉米霜霉病菌检疫检测与鉴定方法1范围本标准规定了玉米霜霉病菌的现场检验及室内鉴定的方法。本标准适用于玉米、甘蔗、高粱等禾本科植物上玉米霜霉病菌的检疫检测与鉴定。2原理玉米霜霉病主要由玉蜀黍霜指霉（Peronosclerosporamaydis）、高梁霜指霉（Psorghi）、菲律宾霜指霉(P.philippinensis)和甘蔗霜指霉（P．sacchari）引起，该类菌（以下简称玉米霜霉病菌Peronoscle-rosporaspp.）属于卵菌纲(Oomycetes)，指梗霉目(Sclerosporales)，指梗霉科(Sclerosporaceae)，霜指霉属(Peronosclerospora)。该病菌都是专性寄生在禾本科植物上(参见附录A)，可侵染玉米的叶片和茎秆造成系统和局部症状。这4种病菌引起的玉米霜霉病有明显的症状，病原菌有其独特的形态特征，用特异引物对病菌DNA进行PCR扩增时可获得特异的DNA片段。病害的症状、病原菌的形态特性以及PCR特异反应特征是鉴定玉米霜霉病菌的主要依据。3试剂与材料棉蓝乳酚油、吐温-20、乙醇、11.5%NaOH、0.015%TrypaneBlue、乳酸、甘油、10倍PCR缓冲液、玉米霜霉病菌DNA的特异性引物、dNTP、Taq酶、5倍TBE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶(0.8%)、吸水纸、无菌水、蒸馏水，1000bpDNAladder等。4仪器及用具盖玻片、载玻片、生物显微镜、高速台式离心机、PCR扩增仪、天平、高压灭菌锅、恒温培养箱、水平电泳仪、凝胶成像系统、PCR反应管、微量移液器、移液器、解剖刀、培养皿、烧杯、漏斗、镊子、分样筛(5mm、4mm、3mm)、吸管等。5现场检测5.1产地检测在寄主大田作物生长期逐行进行田间症状目测踏查。按要求采集有典型症状和疑似症状的玉米霜霉病样本进行室内检验鉴定。玉米霜霉病典型症状参见附录B。5.2调运检测现场核实货物有关单证,核实产地。重点检查来自玉米霜霉病菌发生区的其寄主种子或原粮中是否夹带玉米、高粱、甘蔗等叶片病残体，是否夹带颖壳的高粱种子；带玉米、高梁植株残体的包装、铺垫材料，以及甘蔗插条和其他玉米霜霉病菌寄主种苗叶片是否有可疑病斑，将检获物带回实验室作进一步检验。6室内检测6.1寄主叶片等病残体检测6.1.1直接镜检检测如果寄主叶片上有白色霜霉状物，可直接挑取白色霜霉或撕取带有白色霜霉的病组织制成玻片样品在显微镜下观察病原菌的孢囊梗和孢子囊形态。如果染色观察，加1滴棉蓝乳酚油染色后立即用无1NY/T2050—2011菌水冲洗，然后用吸水纸吸干多余的染色液，加上盖玻片在显微镜下镜检。对藏卵器和卵孢子的观察需采集病叶褐色坏死部位。用镊子取小片病组织,放在载玻片上，加一滴无菌水，用尖头镊子拨开叶肉，放在显微镜下观察叶肉中的藏卵器和卵孢子。病原菌形态特征参见附录C。6.1.2保湿培养检测如果可疑病叶未见有白色霜霉状物,可将病叶切段后分别放在培养皿中用吸水纸保湿,然后置于恒温培养箱并在黑暗中培养，培养箱温度为21℃，相对湿度为100%，5h后每隔0.5h观察1次，连续观察6h，观察孢囊梗及孢子囊的形成、孢子囊萌发长出芽管的过程。观察方法同6.1.1。对于田间有白色霜霉状物的寄主病叶，需收集孢子囊置于18℃、100%相对湿度的培养箱中黑暗培养，1h～2h后观察其萌发情况。6.2种子检测系统发病的玉米霜霉病病株的成熟种子内部含有菌丝，种子颖壳、种皮表面可能带有卵孢子，可采用以下方法确定种子是否被病菌感染。6.2.1洗涤检测从样品中随机取种子100粒,浸入25mL蒸馏水中（加入l滴吐温），振荡10min，取悬浮液，用离心机离心10min(2000g)，弃去上清液，沉淀物用2mL蒸馏水悬浮，镜检至少8滴～10滴悬浮液，观察是否有卵孢子。病原菌形态特征参见附录C。6.2.2透明染色检测从样品中随机取种子400粒，在室温下浸入11.5%NaOH和0.015%TrypaneBlue溶液中24h。浸泡后的种子在自来水中冲洗搅动,然后用5mm、4mm、3mm分样筛分离种子各个部分,胚收集在最底部的分样筛上，胚乳部分溶解到碱液中而无法收集。随后把胚和种皮放在直径为9cm的染色缸中，分别用酒精脱水2min。经脱水后的胚转入带有胶皮管的漏斗中，加入20mL的乳酸甘油混合液（乳酸：甘油：水＝1﹕2﹕1），胚浮在表层，其他碎片沉在底部，然后通过胶皮管把其他碎片放掉。这样反复洗涤5次～6次，直至把碎片洗掉为止，再用镊子小心分离种皮。把胚和种皮分别转入装有乳酸甘油（乳酸：甘油＝1﹕2）的250mL烧杯中,加热煮沸后冷却。最后在实体显微镜下检查乳酸甘油混合液中的种皮，并在显微镜下检查卵孢子和菌丝，卵孢子被染成蓝色，菌丝通常无隔多核、粗壮、有分支。病原菌形态特征参见附录C。6.2.3种植检测将受检样品播于灭菌土壤中，在高湿适温条件下进行隔离种植，观察植株的系统症状。玉米、高梁种植检验时观察时间为播种到出苗6周内，甘蔗观察时间为出苗6周以后。玉米霜霉病典型症状参见附录B。6.3PCR检测上述方法检测后仍不能判断的则进行PCR检测。6.3.1取样方法田间寄主叶片和调运寄主种子取样方法见附录D。6.3.2检测方法按附录E的规定进行。7结果判断田间症状符合附录B描述的；显微镜下病原茵形态符合附录C描述的，都可以确定病原菌为玉米霜霉病菌。如果上述症状或形态特征不明显的，结合PCR检测结果进行判断。2NY/T2050—20118结果报告将实验室检验鉴定结果填入《植物有害生物样本鉴定报告》（见附录F）。9样品处理完成检验后，分离物或病原菌需作为标本保存的，制成标本并妥善保存，否则与其余用于检测的样品应集中销毁，用具应进行灭活处理。10档案保存调查记录和结果报告妥善保存于植物检疫机构。3NY/T2050—2011附录A（资料性附录）玉米霜霉病菌寄主范围A．1高粱霜指霉（P.sorghi）玉蜀黍属(Zeaspp.)、高梁属（Sorghumspp.）、须芒草属(Andropogonspp.)、双花草属(Dichan-thiumspp.)、假蜀黍属(Euchlaenaspp.)、黄茅属（Heteropogonspp.）、黍属(Panic“mspp.)、狼尾草属（Pennisetumspp.）、菅草属(Themedaspp.)。A．2甘蔗霜指霉（P.sacchari）玉蜀黍属(Zeaspp.)、高梁属(Sorghumspp.)、须芒草属(Andropogospp.)、孔颖草属(Bothrioch-loaspp.)、稗属(Echinochtoaspp.)、蟋蟀草属(Eleusinespp.)、假蜀黍属(Euchlaenaspp.)、金茅属(Eulalialiaspp.)、芒属(Miscanthusspp.)、黍属（Panicumspp.）、棒头草属（Polypogonspp.）、甘蔗属(Saccharumspp.)、裂稃草属（Schizachyriumspp.）、狗尾草属(Pennisetumspp.)、磨擦禾属（Tripsa-cumspp.JoA．3菲律宾霜指霉（P.philipyinensis）玉蜀黍属(Zeaspp.)、须芒草属(A，zdropogonspp.)、孔颖草属(Bothriochloaspp.)、假蜀黍属（Eu-chlaenaspp.）、金茅属(Eulaliaspp.)、芒属(Miscanthusspp.)、甘蔗属（Saccharumspp.）、裂稃草属(Schizachyriumspp.)、高梁属(Sorghumspp.)、磨擦禾属（Tripsacumspp.）。A．4玉蜀黍霜指霉（P.maydis）玉蜀黍属(Zeaspp.)、羽高梁(Sorghumplumosum)、墨西哥假蜀黍(Euchlaenamexicana)、狗尾草属(Pennisetumspp.)、磨擦禾属（Tripsacumspp.）。4NY/T2050—2011附录B（资料性附录）玉米霜霉病的症状特征霜指霉属侵染引起的症状基本相似（见图B．1）。其系统侵染病株,由苗期到成株期都可发病。苗期生长缓慢，节间缩短，植株矮化，重病株不能正常抽穗或抽出的果穗与雄花畸形。病叶上出现淡绿色、淡黄色、苍白色或紫红色的条纹或条斑,宽度不等,多与叶脉平行，以后条纹或条斑颜色加深变褐，组织坏死。湿度高时在叶片背面或两面形成灰白色霜霉状物即病菌的孢囊梗及孢子囊。局部侵染在叶片上形成近圆形褪绿斑点,或形成短而窄的褪绿条斑、条纹,后期连接成不规则条斑，变黄褐色于枯。病原菌种类、玉米品种与环境条件不同，症状也有变化。如玉米苗期感染玉蜀黍指霜霉后，全株变淡绿色、黄白色或白色。5NY/T2050—2011附录C（资料性附录）玉米霜霉病菌（Peronosclerosporaspp.）形态特征与相近似属的区别C．1玉米霜霉病菌的形态特征主要根据病原菌的菌丝体、孢囊梗、孢子囊、藏卵器和卵孢子的颜色、形状和大小，卵孢子的有无以及孢子囊和卵孢子的萌发方式进行鉴定。玉米霜霉病菌为专性寄生菌,菌丝纤细，胞间生，多核无色，有吸器伸入寄主细胞。孢囊梗单根或2根～3根由气孔伸出,直立，无色，基部有脚细胞,顶端常二叉状分枝2次～5次，分枝粗短，常排列成半球形。小梗通常2个，顶生一个孢子囊。孢子囊无色，无囊盖,无乳突,萌发产生芽管。藏卵器埋生于叶肉细胞与维管束之间,球形、不规则形。卵孢子多球形，具淡黄色壁，卵孢子壁几乎与藏卵器壁愈合，卵孢子萌发亦生芽管。玉蜀黍霜指霉、高梁霜指霉、菲律宾霜指霉和甘蔗霜指霉按孢子囊大小分2个组：小孢子组孢子囊较小，球形至卵形，包括玉蜀黍霜指霉和高梁霜指霉；长孢子组孢子囊较长，椭圆形至圆筒形，包括菲律宾霜指霉和甘蔗霜指霉。它们之间的具体形态比较见表C．1。表C．1玉蜀黍霜指霉、高粱霜指霉、菲律宾霜指霉和甘蔗霜指霉的主要形态比较表比较项目玉蜀黍霜指霉高梁霜指霉菲律宾霜指霉甘蔗霜指霉菌丝一种较直，偶有分枝；另一种具裂片，不规则分枝成簇分枝，有不规则缢缩或膨大孢囊梗长266.6µm～305.9µm，上部肥大，顶端二叉状分枝2次～4次长100µm～150µm直径7µm～9µm，顶端二叉状分枝1次～3次长150µm～400µm，直径15µm～26µm，顶端二叉状分枝2次～4次单生或2根成束，极少3根束，长160µm～170µm，基部较细,直径10µm～15µm，向上渐粗为基部的2倍～3倍，顶端二叉状分枝2次～3次小梗近圆锥形，弯曲尖，长13µm圆锥形至突锥形，略弯曲，长10µm长圆锥形，弯曲孢子囊近球形或长卵形，顶端稍圆，基部较尖，23µm～38µm×15µm～22µm近球形、卵圆形，15µm～28.9µm×15µm～26.9µm椭圆形、长卵圆形或圆柱形，顶端稍圆，基部微尖，33.5µm～47.5µm×17.5µm～20µm椭圆形至卵圆形，顶端稍圆,基部微尖,25µm～54µm×15µm～23µm藏卵器未见球形、不规则形,直径38µm～50tun罕见。球形，直径22.9µm，壁光滑,常附有藏卵器的柄和雄器残留物红褐色，不规则椭圆形，55yrn～73pm×49µm～58µm卵孢子未见球形,具淡黄色壁，直径25µm～42.9µm罕见。球形，直径15.3µm～22.6µm球形或略成多角形,黄色，直径40µm～50µm，壁