DB21T 1749.3-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程

ICS备案号：辽宁省地方标准DB21DB21/T1749.3—2009黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程2009-10-23发布2009-11-23实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1749.3—2009I前言本标准附录A、附录B、附录C、附录D、附录E为规范性附录。本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准起草单位：辽宁省植物保护站。本标准主要起草人：蔡明、宋雅坤、吴元华、李明福、江冬、李眷、李维根。DB21/T1749.3—20091黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程1范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV）的检验检测与鉴定方法。本标准适用于全省各地开展黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检测工作。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1检验inspection对植物、植物产品或其他限定物进行官方的直观检查以确定是否存在有害生物和/或是否符合植物检疫法规。2.2检测detection为确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物而进行的除肉眼检查以外的官方检查。2.3鉴定identification对可疑的有害生物是否与已知物种同一的鉴别过程。2.4发生happen官方报道在一个地区存在着土生或传入的有害生物，和/或官方未报道在一个地区存在的有害生物已经被根除。3原理黄瓜绿斑驳花叶病毒属烟草花叶病毒属。其病原形态特征见附录A，其寄主范围、地理分布、生物学特性、危害症状和传播途径见附录B，其血清学检测技术，应用双抗体夹心酶联免疫吸附法技术（ELISA）测定和分子生物学（PCR）测定，具体检测方法见附录C、附录D。4材料、仪器、用具及药品4.1材料葫芦科作物种子、叶片和果实。4.2仪器、用具电子显微镜、台式离心机、分光光度计、RT-PCR仪、冰箱、酶联板、酶联读数仪、微量加样器、洗瓶、载玻片、玻棒、研钵、微量离心管、培养皿、打孔器、滴管、吸管、量筒、三角瓶、水浴锅、毛细管、针头、电泳仪、水平电泳槽、胶手套、剪刀、镊子、自封袋、油性笔、标签、记录本等。4.3药品专化性抗体免疫球蛋白1gG(浓度约为1mg/mL)、酶标记羊抗兔抗体球蛋白1gG(市售)、碳酸钠(无水)、碳酸氢钠、叠氮化钠、磷酸氢二钠(无水)、磷酸二氢钾(无水)、氯化钠、氯化钾、Tween-20、鸡蛋清粉、聚乙烯吡咯烷酮、亚硫酸钠(无水)、牛血清白蛋白、二乙醇胺、氯化镁等。DB21/T1749.3—200925现场检验鉴定5.1种子检查在11月～翌年2月份对市场销售的葫芦科作物种子和砧木种子进行扦样，每份样品取100粒，送指定的有关部门进行检测。重点检查用做砧木的种子。5.2田间调查3月～10月份在黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生期，选择有代表性地块，检查叶片、果梗、果实，看叶片上是否出现黄绿相间斑驳、隆起、皱缩、蕨叶，果梗是否有褐色条斑，果实表面是否有斑驳、凸起，果实内部是否有空洞、黄丝、果肉暗红倒瓤等。5.3症状检验从植株上摘取病叶或果实，与附录B记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的为害症状进行比较，符合附录B记述的黄瓜绿斑驳病毒为害症状的为疑似病株。或在调查现场将病叶取下，用快速诊断试纸条或诊断试剂盒（附录E）进行初步诊断。5.4病害发生分级标准(以株为单位)——0级：无任何症状；——1级：心叶明脉，轻微花叶，发病面积占整个植株面积的5%以下；——3级：心叶及少数叶片花叶，发病面积占整个植株面积的6～15%；——5级：多数叶片花叶，少数叶片皱缩、畸形，植株轻微矮化，发病面积占整个植株面积的16%～30%；——7级：多数叶片严重花叶，多数叶片皱缩、畸形，植株矮化，或叶柄有褐色坏死斑点，发病面积占整个植株面积的31%～50%；——9级：严重发病，叶片严重畸形，植株严重矮化，茎部有褐色条斑，发病面积占整个植株面积的51%。以上。5.5病情指数按下式计算。100)(INinDi…………………………………（1）式中：Di——病情指数；n——各级病株数；N——该病级数；i——调查总株数；I——最高级数。6实验室检测鉴定经现场检验检测，不能确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒的，取样带回实验室进行检测鉴定。6.1取样方法在发病植株上，随机选取发病叶片或果实（其数量以满足检测鉴定所需为限），装入聚乙烯塑料袋中密封，贴好标签带回。标签应注明采集时间、地点、采集人等信息。对所采集的样本，应放入低温（4℃）密闭保存，要尽早进行鉴定。6.2病毒鉴定将所采集的样本进行血清学检测技术（ELISA）或分子生物学技术（PCR）测定，将检测结果与附录A记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的病原特征进行比较，符合附录A记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒病原特征的，确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。DB21/T1749.3—200937标本保存7.1应配有田间调查的植株、叶片、花、果实等资料，症状照片;当地专家的初步鉴定或识别结果。7.2样品采集应以幼嫩叶片为主，特殊材料可以根据具体情况灵活掌握，样品数量不少于200g/份，每个标样2份，提倡冻干样品（冷冻样品），送指定的专家鉴定。7.3当地设法保存活体样品，以备应急使用。7.4适合压制的叶片标本，应随采随压于标本夹中。7.5记载寄主名称、发病情况、环境条件、采集地点、采集日期、采集人姓名等。DB21/T1749.3—20094附录A（资料性附录）黄瓜绿斑驳花叶病毒分类命名和病原特征A.1分类和命名A.1.1学名Cucumbergreenmottlemosaicvirus（CGMMV）A.1.2分类地位烟草花叶病毒属(Tobamovirus)A.1.3病毒异名Tobaccomosaicviruswatermelonstrain,Cucumbervirus3,Cucumbervirus4,Cucumidvirus2A.2病原特征A.2.1病毒粒子直棒状病毒，长300nm，宽15nm。沉淀系数185S。等电点pH4.98；A260/280＝1.38。A.2.2核酸核酸含量5％，单链RNA，分子量2×106。G:A:C:U=23.2:24.6:20.6:31.6。A.2.3蛋白蛋白含量95％，分子量17261。氨基酸160，其组成为Ala21、Arg8、Asp20、Cys0、Glu10、Gly9、His1、Ile7、Leu18、Lys4、Met0、Phe9、Pro6、Ser24、Thr10、Trp2、Tyr4、Val7。A.2.4病毒株系根据不同分离物的血清学反应及其对苋色藜和蔓陀罗的症状反应，将其分为以下株系。主要有英国和欧洲报道的典型株系（Ainsworth,1935），日本报道的黄瓜株系（cucumberstrain）、西瓜株系（Watermelonstrain）和Yodo株系（Yodostrain），以及印度C株系(Hollingsetal.，1975)。DB21/T1749.3—20095附录B(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒的寄主范围、地理分布、生物学特性、为害症状、传播途径及鉴别寄主B.1寄主范围B.1.1自然寄主西瓜、南瓜、甜瓜、黄瓜、葫芦、西葫芦、瓠瓜。B.1.2寄主范围苋色藜、蔓陀罗、甜瓜、笋瓜、西葫芦、葫芦、丝瓜、烟草。B.2地理分布目前，CGMMV在世界已广泛分布，欧洲的英国、爱尔兰、德国、荷兰、丹麦、俄罗斯、希腊、奥地利、捷克、斯洛伐克、芬兰、南斯拉夫、罗马尼亚、摩尔多瓦、波兰、乌克兰、拉托维亚、保加利亚、捷克、匈牙利、西班牙、瑞典；南美洲的巴西；亚洲的日本(Yodo、Ibaraki、松山、德岛、北海道、千叶)、印度(Uttar-Pradesh、Delhi)、韩国、巴基斯坦(西北部边境省份)、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、朝鲜及我国的辽宁、河北、山东、广东、湖北等省发生。B.3生物学特性B.3.1致死温度黄瓜绿斑驳花叶病毒的致死温度为90℃~100℃B.3.2稀释限点黄瓜绿斑驳花叶病毒的稀释限点为10-6~10-7mL/LB.3.3体外存活期体外存活期较长，达119d以上。在0℃可保持数年，－20℃病毒仍能存活。病毒在种子内可存活240d～540d，病残体在土壤内深埋420d，病毒仍有侵染活性。B.3.4病毒粒体形态电镜观察病毒粒体为棒状，长约300nm，宽15nm。B.4为害症状B.4.1西瓜染病症状幼叶出现淡黄色花叶，其后出现斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑等，随叶片老化症状减轻。有时也呈叶脉绿带状。果实表面浓绿圆斑，果蒂处有时坏死，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞，并且呈丝状纤维化，腐烂变味，不能食用。B.4.2甜瓜染病症状感病后茎端新叶出现黄斑，但随新叶老化症状减轻。成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。果实有两类症状，一种在果实表面出现绿色斑。另一种在绿色部的中心出现灰白色部分。B.4.3黄瓜染病症状感病初期新叶出现黄色小斑点，以后黄色部分扩展成花叶，并发生浓绿瘤状突起，出现叶脉绿带。发病轻时果实只出现淡黄色圆形小斑点，严重时出现浓绿色瘤状突起变成畸形。B.5传播途径B.5.1传播方法CGMMV有多种传播方式：1.种子传播；2.接触传染（包括植物间接触、农事操作、汁液）；3.介体DB21/T1749.3—20096传毒（如菟丝子、黄瓜叶甲）；4.花粉传毒；5.病残体6.其他（啮齿动物的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的牛粪）。其中带毒种子是远距离传播主要途径。接触性传染是近距离传播主要途径。B.5.2.2侵染循环该病毒在种子、病株残体、土壤中均可越冬，成为第二年的初侵染来源。带毒种子是主要初侵染源。在田间，CGMMV能很容易地通过病株的汁液接触传播，人工嫁接和授粉等方式易再传染。因此，田间农事操作如整枝、上架、摘心、授粉、嫁接、摘果均可导致该病毒的再次传播。B.5.3流行与环境发病受温度影响，在16℃时侵染至发病需2～3周，显病较轻；在28℃～35℃下接种1周即可发病，症状重。CGMMV适生性和抗逆性极强，所有株系都是极端稳定的，其致死温度90~100℃，稀释限点10-6~10-7，常温下病毒侵染力可保持数月，在0℃可保持数年，－20℃病毒仍能存活，一旦条件适宜还能继续传播蔓延。田间一旦发病，如未进行特殊的杀灭处理，病株残体中的病毒可存活多年，即便将病根埋在土壤内365d以上，病毒仍保持侵染能力。B.6鉴别寄主B.6.1黄瓜新叶出现黄色小斑点，后呈花叶并带有浓绿色突起，叶脉间褪色呈叶脉绿带状。B.6.2西瓜茎端幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凸凹斑，随叶片老化症状减轻。果实表面浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞。B.6.3甜瓜新叶出现黄斑，但随叶片老化呈叶脉绿带状。B.6.4瓠瓜叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化呈叶脉绿带状。B6.5葫芦幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻。B.6.5苋色藜经西瓜株系、Yodo株系和印度C株系侵染后出现细小局部坏死斑，而欧洲黄瓜株系不出现这种症状；无系统侵染。B.6.6蔓陀罗Yodo株系和日本的黄瓜株系在接种后7d产生能扩散的局部褪绿斑；无系统侵染。DB21/T1749.3—20097附录C(规范性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DoubleantibodysandwichELISA）标准C.1仪器和用具C.1.1仪器设备离心机、电子天平（1/10000g）、酶标仪等。C.1.2用具可调移液器（20µL～200µL、200µL～1000µL）及相关吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、量筒、烧杯等。C.2试剂C.2.1包被缓冲液无水碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，叠氮化钠0.2g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH至9.6，4℃贮存。C.22洗涤缓冲液（PBST）磷酸氢二钠（无水）1.15g或磷酸氢二钠（十二水）2.9g，磷酸二氢钾（无水）0.2g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5g蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.4，室温贮存。C.2.3提取缓冲液鸡蛋清粉