db51 t 724-2007 水稻细菌性条斑病检验鉴定技术规程

ICS65.020.20B16DB51四川省地方标准DB51/724—2007水稻细菌性条斑病检验鉴定技术规程RuleofDetectionMethodforXanthomonasoryzaepv.oryzicola2007-11-1发布2007-12-1实施四川省质量技术监督局发布DB/T724—2007I目次前言.................................................................................II1范围................................................................................32规范性引用文件......................................................................33术语和定义..........................................................................34原理................................................................................35试剂与材料..........................................................................36仪器及用具..........................................................................47取样................................................................................48症状识别............................................................................49实验室检验..........................................................................410结果判断...........................................................................511样品处理...........................................................................5附录A................................................................................6DB/T724—2007II前言本标准的附录A是资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省农业厅植物检疫站负责起草，重庆大学参加实验。本标准主要起草人：陈素清、谢成伦、赵兰鸰、吴志平、李耄、王中康、肖连康。DB/T724—2007水稻细菌性条斑病检验鉴定技术规程RuleofDetectionMethodforXanthomonasoryzaepv.oryzicola1范围本规程规定了水稻细菌性条斑病（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola（Fangetal.）Swingsetal）的取样方法、田间症状识别、实验室检验鉴定技术要求。本规程适用于水稻细菌性条斑病菌检验和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB8371-1987《水稻种子产地检疫规程》GB15569-1995《农业植物调运检疫规程》3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1水稻细菌性条斑菌Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fang)Swingsetal.指引起水稻细菌性条斑病的病原细菌。属薄壁细菌门（Gracilicutes）、假单胞菌科（Pseudomonaceae）、黄单胞菌属（Xanthomonas）。3.2ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附法，是一种利用酶标记抗体催化底物显色来指示抗原抗体的结合的免疫学方法。4原理水稻细菌性条斑病菌能侵染水稻植株，通过带菌种子远距离传播，在带菌量很少时，用分离培养等方法难以检测病原菌，用血清学的酶联免疫间接法（PAS-ELISA）检测是目前行之有效的检验方法，其原理是利用水稻细菌性条斑病抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化反应，形成酶标记的特异性免疫复合物。当碱性磷酸酶标记的免疫复合物与相应底物结合，并催化无色底物生成有色产物，根据显色反应，判断被检样品是否带菌。5试剂与材料除非另有说明，在检验中使用试剂均为分析纯和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.1样品提取液取1.15g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、8g氯化钠（NaCl）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。3DB/T724—20075.2洗涤液取1.15g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、8g氯化钠（NaCl）、0.5g吐温－20，用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。5.3无脂奶粉nonfatdriedmilk5.4封闭液取5g无脂奶粉，用100mL样品提取液溶解。5.5包被液取2.93g碳酸氢二钠（Na2HCO3）、1.59g氯化钠（NaCl）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调pH值到9.6。5.6抗体稀释液取2.5g无脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。5.7抗体效价为1：10000的兔抗水稻细菌性条病菌抗体球蛋白。抗体稀释度为1：100。5.8酶标抗体市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体球蛋白。5.9底物缓冲液用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁（MgCl2）、0.02g叠氮化钠（NaN3）、9.7mL二己醇胺（CH2CH2OH）溶解后，调PH值到9.8，定容到100mL。5.10底物溶液将5mg对硝基苯磷酸盐（C6H5NO3）溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10min内，避光条件下制备。5.11终止液将12g氢氧化钠（NaOH），用100mL蒸馏水溶解。6仪器及用具小型粉碎机、恒温箱、酶联板、微量移液器、放大镜、显微镜、载玻片、盖玻片、容器、吸水纸、小烧杯等。7取样7.1叶片取样在水稻四叶期、拔节期、特别是孕穗至齐穗期，按照GB8371-1987《水稻种子产地检疫规程》6.1要求，进行田间调查，发现水稻细菌性条斑病典型症状或疑似症状的，取样送实验室检验鉴定。7.2种子取样按照GB15569-1995《农业植物调运检疫规程》6.1要求抽样。8症状识别在水稻生长期间，用踏查目测方法检查，发现叶片上有与水稻细菌性条斑病田间症状特征相同或疑似的，可通过症状进行初步判断。水稻细菌性条斑病田间症状识别见附录A。9实验室检验9.1细菌菌溢检查将田间采回的样本，切取植株病健交界处组织约20mm2，放在载玻片的水滴中，盖上盖玻片，在低倍显微镜下检查，有无云雾状菌液自叶脉间涌出。9.2ELIAS间接法检验9.2.1制样9.2.1.1植株样品将供试样品剪成20mm2小片，装在小烧杯中，按照供试样品质量（g）+包被液体积（mL），1+20的比例加入包被液，浸泡10min。4DB/T724—20079.2.1.2种子样品取种子20g，用小型粉碎机粉碎10s，使谷壳破裂。将样品用25mL包被液浸泡10min。9.2.2包被9.2.2.1点样将制备好的样品混合后放置1min，取上清液100μL点于酶联板各反应孔中，每个样品三次重复。设置灭活菌液为阳性对照、水稻健康组织浸泡液为阴性对照。9.2.2.2封闭将酶联板置于37℃的恒温箱中至酶联板反应孔中的样品完全干燥。在每个反应孔中加入200μL封闭液，置于密封且可保湿的容器中，25℃恒温孵育30min。9.2.2.3洗板将反应孔中的液体倒出,用洗涤液加满每个反应孔，静置1min～2min后，将洗涤液倒出，重复2次。洗板完成后将酶联板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中的水分。9.2.3结合抗体9.2.3.1加抗体每孔加入100μL用抗体稀释液稀释100倍的抗体，置于保湿容器中，25℃孵育1h。9.2.3.2洗板在每个反应孔加入洗涤液，倒出，再加入洗涤液，静置3min后将洗涤液倒出。再重复2次。洗板完成后将酶联板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中的水分。9.2.4结合酶标抗体9.2.4.1加酶标抗体每孔加入100μL按照使用说明书要求稀释的酶标抗体。孵育方法同9.2.3.1。9.2.4.2洗板同9.2.3.2。9.2.5显色每孔加入100μL底物溶液。25℃避光孵育30min～60min。9.2.6终止反应显色后在每孔中加入50μL终止液。10结果判断10.1症状判断田间植株症状符合附录A的特征，且有菌溢，判断为水稻细菌性条斑病。10.2ELISA检验肉眼观察ELIAS显色反应结果，反应孔中三个重复均显示为黄色，样品为阳性，即带水稻细菌性条斑病菌。反应孔没有颜色变化，样品为阴性，即不带水稻细菌性条斑病菌。11样品处理用于水稻细菌性条斑病检测的样品、用具在完成检验后，用具应进行灭活处理，样品集中销毁。5DB/T724—20076附录A（资料性附录）水稻细菌性条斑病症状特征A.1水稻细菌性条斑病田间症状特征水稻细菌性条斑病在叶片上形成暗绿色或黄褐色的狭窄条斑。初发期为暗绿色水渍状半透明小斑点，很快纵向扩展，但受叶脉限制，形成宽约0.25mm，长约1mm~5mm的条斑，随后，单个病斑可扩大到宽1mm、长10mm以上，转为黄褐色。病斑上带有成串的黄色珠状细菌溢出，俗称“菌脓”，形小而量多，色深，不易脱落。病情严重时，多个病斑聚集一起，形成不规则的黄褐色至桔红色斑块，对光观察，病斑部半透明，水浸状。苗期即可见到典型症状。A.2水稻细菌性条斑病与水稻白叶枯病(Xanthomonasoryzae)田间症状特征比较水稻细菌性条斑病菌与水稻白叶枯病菌同属黄单胞菌属（Xanthomonas）的细菌，其田间症状主要区别见表A。表A水稻细菌性条斑病与水稻白叶枯病田间症状特征比较水稻细菌性条斑病水稻白叶枯病发病部位叶面任何部位从叶尖或叶缘开始病斑形状初为暗绿色针头状油点，后扩展成由黄绿色到黄褐色，受叶脉限制形成细条病斑。初为暗绿色短线状，继发展成黄绿色长条纹状，后为灰白色条斑，病、健组织界线明界线明显，分界处成波纹状。对光透视病斑半透明不透明菌脓田间湿度较低时，也可产生菌脓。腊黄色、露珠状、较小而量多、不易脱落。田间湿度大时，产生菌脓。蜜黄色、珠状、大而量少、易脱落。