肿瘤血管抑制剂XY-02-与CA4P-的组织分布比较研究

中国测试CHINAMEASUREMENT&TESTVol.41No.10October，2015第41卷第10期2015年10月肿瘤血管抑制剂XY-02与CA4P的组织分布比较研究宁欣1袁陈芙蓉1袁张玉霞1袁冯亚男1袁王梦丽1袁谢红英1袁雍智全2袁徐小平1（1.四川大学华西药学院，四川成都610041；2.广东达信生物科技有限公司，广东东莞523808）摘要院建立HPLC对肿瘤血管抑制剂XY-02与CA4P在大鼠体内组织分布规律的研究方法袁揭示两种药物靶组织的差异与潜在的治疗特征和安全性遥SD大鼠分别静脉注射XY-02渊80mg/kg冤或CA4P渊1mg/kg冤袁于给药后15袁40袁90min采集大鼠心尧肝尧脾尧肺尧肾尧胃尧小肠尧脑尧子宫尧睾丸等组织进行含量测定袁以C18渊250mm伊4.6mm伊5滋m冤为色谱柱袁0.01%乙酸-甲醇渊50颐50袁淄/淄冤为流动相袁流量为1.0mL/min袁检测波长为325nm遥XY-02和CA4P分别在0.15耀750滋g/mL和0.03耀60滋g/mL范围内线性关系良好渊r跃0.9995冤袁检测限分别为17ng/mL和4.93ng/mL遥两种肿瘤血管抑制剂均在大鼠组织中有广泛分布和快速消除的特点袁预示二者可对各种组织肿瘤具有潜在的治疗作用且体内产生蓄积的可能性小遥特别是XY-02在肾脏和肝脏中分布较多袁提示XY-02可对临床上较难治疗的肾癌和肝癌有更好的治疗价值曰XY-02在心脏和肠道的分布较CA4P低袁表明XY-02的心脏毒性和肠道的不良反应比CA4P更小袁安全性更好遥关键词院XY-02曰CA4P曰静脉给药曰HPLC曰组织分布文献标志码院A文章编号院1674-5124渊2015冤10-0053-05ComparisonsoftissuedistributionoftumorvascularinhibitorsXY-02andCA4PNINGXin1，CHENFurong1,ZHANGYuxia1,FENGYa’nan1，WANGMengli1，XIEHongying1，YONGZhiquan2，XUXiaoping1（1.WestChinaSchoolofPharmacy，SichuanUniversity，Chengdu610041，China；2.DongguanDaxinBiotechCo.，Ltd.，Dongguan523808，China）Abstract:AHPLCmethodwasdevelopedforthecomparativestudyofthetissuedistributionofCA4PandXY-02inrats.Thetestrevealedthedifferencesintargettissuesaswellasthepotentialtreatmentandsafetyfeaturesofthetwotumorvasculartargetinginhibitors.AfterintravenousadministrationofXY-02（80mg/kg）orCA4P（1mg/kg），sampleslikeheart，liver，spleen，lung，stomach，intestine，brain，testis，uterusweretakenat15，40，and90minafterdosing.TheseparationwasperformedonaODScolumn（250mm伊4.6mm伊5滋m）withmobilephasemethanol-0.01%aceticacid（50:50，淄/淄）.Thewavelengthwassetat325nmandtheflowratewas1ml/min.Calibrationstandardsshowthattheexcellentlinearityrangeis0.15-750滋g/mLforXY-02and0.03-60.0滋g/mLforCA4P（r0.9995）.ThelowestdetectableconcentrationofXY-02andCA4Pis17ng/mLand4.93ng/mL，respectively.TheresultsindicatethatbothXY-02andCA4Parewidelydistributedandrapidlyeliminatedintissues，suggestingthattheymayhavepotentialtreatmenteffectinvivotumorsindifferenttissuesandthepossibilityofaccumulationinvivoislittle.TherelativelyhighdistributionofXY-02inkidneyandliverdemonstratesthatitmayhaveabettervalueintreatingkidneyandlivercancers.ComparedwithCA4P，XY-02islowerincardiotoxicityandgastrointestinaladversereactionandmuchsafer.Keywords:XY-02；CA4P；intravenousadministration；HPLC；tissuedistributiondoi院10.11857/j.issn.1674-5124.2015.10.012中国测试2015年10月收稿日期院2015-04-15曰收到修改稿日期院2015-05-28基金项目院2014年东莞市引进创新创业领军人渊201476815冤作者简介：宁欣渊1991-冤袁女袁四川绵阳市人袁硕士研究生袁专业方向为药品质量控制和药物代谢分析遥0引言XY-02，化学名为（E）-3-（3忆-羟基-4忆-甲氧苯基）-2-（3忆，4忆，5忆-三甲氧苯基）丙烯酸叔丁铵盐，中文名为康丁胺；CA4P，化学名为2-甲氧基-5-[（1Z）-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）乙烯]苯酚磷酸酯二钠，中文名为康普瑞丁磷酸二钠盐[1-2]皆为肿瘤血管抑制剂Combretastatin类化合物的同系物。Combretastatin类化合物系从南非灌木CombretumCaffrum的树皮中分离得到的一类具有顺式二苯乙烯结构的天然产物[3-4]，20世纪90年代，获得其全合成产品，后经结构修饰获得从CA1耀CA32的系列化物，其中最具生物活性的主要有CA1和CA4。其作用原理为靶向作用于肿瘤血管异常增生的内皮细胞，诱导增生的内皮细胞出现炎症样反应，引起细胞凋亡和血管壁萎缩，切断通向肿瘤的血流供应，使肿瘤发生“饥饿性”坏死，达到抑制肿瘤生长的目的[5-6]。然而这类化合物最大的缺陷是水溶性极差，难以制剂成型，所以前期将CA4经磷酸酯化后形成二钠盐作为前体药物CA4P，CA4P在体内经磷酸酯酶水解出母体CA4而发挥抑瘤作用[7]。目前，CA4P已经进入临床II期试验，正在进行单独治疗或与紫杉醇、卡铂联合治疗晚期癌症的临床试验[8-10]。CA4P的结构如图1（a）所示。即使CA4P具有一定水溶性，其水解后仍然是不溶于水的CA4，而且CA4P在水溶液中易发生顺反式转化，因此CA4P仅能制剂成冻干注射剂，限制了其向其他给药途径的制剂开发。为克服CA4P前体水解后的CA4水溶极差的问题，XY-02通过组合化学优化出水溶性更好的XY-02化合物，化学结构如图1（b）所示。药理毒理试验结果表明，XY-02与CA4P的疗效相当，体内平均抑瘤率约70%，安全性更好（LD50为2g/kg）。良好的水溶性，使得XY-02可更广泛地开发成各类制剂，特别是便于临床使用的口服制剂。虽然关于XY-02和CA4P的药物代谢动力学研究分别已有报道[11-13]，但在动物体内的相关组织分布，特别是二者组织分布比较的研究尚未见报道。为此，本文通过高效液相色谱法（HPLC）分别检测XY-02和CA4P在大鼠各组织的浓度分布，比较其分布规律，并阐明其分布特征与药效学和毒理学之间的潜在关系，为进一步研究开发和临床应用提供组织分布的基础依据。1实验部分1.1仪器与材料液相色谱仪系统LC-2010A（日本岛津公司）；可见-紫外分光光度仪UV2300（上海天美科学仪器有限公司）；BT125D电子分析天平（Sartorius公司）；TGL-16GAnke飞鸽牌高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；GL-88B旋涡振荡器（海门麒麟医用仪器厂）；XHF-1内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；纯水仪。XY-02对照品和供试品（质量分数逸99.50豫，自制）；内标1阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所）；CA4对照品、CA4P对照品和供试品（99豫，自制）；内标2（E）-3-（4忆-甲氧苯基）原2原（3忆、4忆、5忆原三甲氧苯基）原2原丙烯酸（质量分数逸99豫，自制）；甲醇（色谱纯，FISHER）；乙腈（色谱纯，FISHER）；高氯酸、甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸等其他化学试剂均为分析纯；超纯水（自制）。1.2动物成年健康SD大鼠，雌雄兼用，体重（170依20）g，由四川大学实验动物中心提供。饲养于四川大学实验动物中心普通小动物房，雌雄分笼；饲养条件符合GB14925———2001《实验动物环境及设施》。环境温度（19依3）益，湿度55%依15%。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Aichromband-AQC18（250mm伊4.6mm伊5滋m）；流动相:0.01%乙酸-甲醇（50颐50，淄/淄)；流量为H3COH3COH3COCCCHOOHOCH3ONH3C渊CH3冤3渊b冤C23H31NO7渊XY-02冤CHCHOCH3OPO3Na2H3COH3COH3CO渊a冤C18H19Na2O8P渊CA4P冤图1XY-02和CA4P的化学结构图54第41卷第10期1.0mL/min；检测波长为325nm；柱温为35益；进样量为20滋L。2.2溶液的配制2.2.1XY-02、CA4P对照品储备溶液的制备精密称取XY-02对照品18.8mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为750滋g/mL的XY-02对照品储备液。精密称取CA4P对照品15.0mg于25mL量瓶中，加甲醇溶液溶解稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为600滋g/mL的CA4P对照品储备液。于冰箱约4益存放。2.2.2内标液的制备精密称取内标1对照品13.1mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为5.24滋g/mL的内标1溶液。于冰箱约4益存放。精密称取内标2对照品10.3mg，置于10mL容量瓶加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL于100mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为1.03滋g/mL的内标2溶液。于冰箱约4益存放。2.3样品的处理取大鼠各组织匀浆100滋L，置于1.5mL离心管中，加入内标1（5.24滋g/mL）100滋L或内标2（1.03滋g/mL）100滋L，加入10%高氯酸100滋L，涡旋混合3min，静置，以12000r/min离心10min，取上清液作为供试品溶液。2.4方法学验证2.4.1标准曲线1）XY-02的标准曲线。取100滋L空白心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、睾丸、子宫组织匀浆液各8份，均分别加入0.15，0.75，3，15，75，150，375，750滋g/mL的XY-02对照品溶液100滋L（含内标1，5.24滋g/mL），加入10%高氯酸100滋L，按“2.3”项下方法操作，制备出标准曲线溶液。2）CA4的标准曲线。取空白大鼠各组织匀浆液各6份，均分别加入0.03，0.06，0.3，3，6，60滋g/mL的CA4对照品溶液100滋L（含内标2，1.03滋g/mL），加入10%高氯酸100滋L，按“2.3”项下方法操作，制备出标准曲线溶液。精密量取上