陶瓷化骨的磷酸钙丹参涂层及对成骨细胞生长影响的研究

-30-*,XunxiangTan1,HaiyangJu1,XiugangSong1,ZhiyeQiu21.WendengHospitalofTraditionalChineseOrthopedicsandTraumatology,WendengShandong264400,China2.DepartmentofMaterialsScienceandEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,ChinaAbstractThepresentworkistoinvestigatethephysicochemicalandbiologicalpropertiesoftrueboneceramiccoatedwithcalciumphosphate/Danshencompound,andofferanidealscaffoldmaterialforbonetissueengineering.Inthestudy,surfacecoatedtrueboneceramicwereobtainedbyfullymixedwithCalciumphosphate/Danshencompoundandsuckedundernegativepressure.Scanningelectronmicroscopy(SEM),X-raydiffraction(XRD)andenergydispersivespectroscopy(EDS)wereemployedtostudythecoatedcomposition.Thescaffoldwasco-culturedwithosteoblastderivedfrombonemarrowstromalcells,alkalinephosphatase(ALP)activityat2,4,6and8daysofcultivationweremeasured.TheresultsindicatedthattherewasnoobviouschangeiningredientandCa/Pratioofsurfacecoatedtrueboneceramic,andthenaturalthree-dimensionalporousstructurewasremained.TheALPactivitywashigherinthesurfacecoatedgroupthaninthecontrolgroup,indicatedthatthesurfacecoatedtrueboneceramicsignificantlypromotedcellsadhesion,proliferationandsecretion.Therefore,bioactivityoftrueboneceramicwasincreasedbythesurfacecoatingofcalciumphosphate/Danshencompound,suchcoatingcompositionwithseedcellsisanidealmaterialforbonerepair.KeyWords:TrueBoneCeramic;CalciumPhosphate;Danshen;SurfaceCoating;Osteoblast陶瓷化骨的磷酸钙/丹参涂层及对成骨细胞生长影响的研究姜红江1*，谭训香1，鞠海洋1，宋修刚1，仇志烨21.山东文登整骨医院，山东文登2644002.清华大学材料科学与工程系，北京100084摘要：本研究探讨陶瓷化骨磷酸钙/丹参涂层后理化及生物学性能的变化，提供理想的骨组织工程支架材料。在研究中，将陶瓷化骨与磷酸钙丹参充分混合、负压抽吸，得到均匀涂层。样本分别进行X线衍射（XRD）分析及X线能谱（EDS）分析、扫描电镜（SEM）观察，了解理化性能变化；与骨髓来源的成骨细胞联合培养观察，检测ALP活性，评价其生物学性能。结果表明，陶瓷化骨表面涂层后成分、Ca/P比无明显变化，保留了天然的三维多孔结构，与成骨细胞联合培养ALP活性明显高于对照组，能促进成骨细胞的增殖和分泌。因此，陶瓷化骨经含生物活性因子或药物的磷酸钙涂层后，增加了生物活性，与成骨细胞复合后是一种理想的骨修复材料。关键词：陶瓷化骨；磷酸钙；丹参；表面涂层；成骨细胞引言陶瓷化骨（Trueboneceramic，TBC）的化学成分主要为羟基磷灰石(HA)，纯度高，其钙磷比值与人骨基本相同，具有原骨的骨小梁，小梁间隙及骨内管系统，保持了原骨的精细结构，具有良好的骨传导性，这基金项目：受山东省中医药科学技术研究项目资助（2005-2006-83）-31-就解决了化学合成人工骨的孔隙率、孔隙交通及孔径大小等方面的制作难题，并且经高温煅烧后，其有机成分已经完全去除，因此消除了异种骨的抗原性，同时也消除了异种骨中可能携带的病原微生物，是较为理想的骨组织工程支架材料。但是，陶瓷化骨不具有促进成骨作用等生物活性，本研究拟采用可降解的磷酸钙丹参对其表面改性，使其获得生物活性，以更适于临床的需要。1材料和方法1.1主要仪器与试剂分析纯试剂：NaOH，氯仿，甲醇，30%H2O2，CaCl2，LiCl，丹参注射液（每安瓿2ml，含有丹参2g，上海中西药业股份有限公司），自固化磷酸三钙（calciumphosphatecement，CPC，上海瑞邦生物材料有限公司），程控箱式电炉（SXL-1208型，上海），X线衍射仪（Rigaku-D/Max-2500型，日本），扫描电镜（XL30E型，荷兰）。1.2陶瓷化骨的制备取新鲜成年牛骨胫骨上端或股骨下端的松质骨，彻底清除软组织及骨髓，制成一定结构的块状骨。经以下步骤脱脂脱蛋白：(1)0.5mo1/LNaOH，12h；(2)1:1氯仿甲醇，1h；(3)30%H2O2，24h；(4)2mol/LCaCl2，1h；(5)8mol/LLiCl，1h；40°C，恒温干燥。每个步骤之间均用三蒸水清洗3次。随后将标本置于箱式电炉中缓慢加温800°C，煅烧3h，自然降温取出，清洗，环氧乙烷消毒备用。1.3陶瓷化骨的表面涂层每2gCPC粉末加入丹参注射液（浓度为1000mg/ml，pH值为7.35），与固化液充分混匀后，与陶瓷化骨混合，进行负压抽吸使磷酸钙药物混合液充分渗入到陶瓷化骨孔隙中，随机取部分样本做X线衍射（XRD）分析及X线能谱（EDS）分析和扫描电镜（SEM）观察。1.4复合陶瓷化骨的生物学评价1.4.1骨髓基质细胞原代培养及诱导取成年雄性新西兰白兔，无菌条件下于髂嵴部用16号骨穿针穿刺，抽取骨髓1~2ml，用1640培养液稀释制成细胞悬液。将骨髓细胞悬液以2×106/ml的细胞浓度分别接种于2只50ml培养瓶中，置37°C，5%CO2及饱和湿度条件下培养。4天后首次换液，细胞长满后0.25%的胰酶消化传代。传至第2代时加入含15%胎牛血清、50mg/L维生素C、10-8mol/L地塞米松的1640培养液进行诱导培养，细胞长满后，传代培养。1.4.2传代细胞的种植及生长情况无菌陶瓷化骨及改性陶瓷化骨切割成约5mm×10mm×10mm大小备用，实验分两组进行，每组24块。将培养的传代细胞以2×108/ml细胞浓度分别接种于置有陶瓷化骨及改性陶瓷化骨的24孔培养板，联合培养，每2天换液，倒置显微镜每日观察细胞生长情况。于联合培养第3、6天，各取1块，D-Hank’s液冲洗，2%戊二醛固定1小时，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯浸泡过夜，以固体CO2作临界点干燥，旋转喷镀金膜，制作电镜标本，观察细胞在陶瓷化骨孔隙表面内的生长情况。分别于接种培养第2、4、6及8天，每组取6孔，换液时吸出培养液，使用全自动生化仪（ADZIA-2400型，SIEMENS）进行ALP活性检测，计算平均值。2结果2.1大体标本观察煅烧后的牛松质骨外观形态不变，保持了原骨组织的多孔网状结构，其原骨组织骨盐支架的三维多孔结-32-构存在，松质骨孔隙交错相通，色白，质脆（见图1），力学测试其抗压强度为196MPa。图1陶瓷化骨2.2TBC的组成成分X线衍射分析结果显示，陶瓷化骨的主要组成是结晶HA，表面涂层后陶瓷化骨材料中主要成分仍为结晶HA，同时还含有微量的CaCO3（图2）。X射线能谱分析结果表明，TBC的钙磷原子数量比为1.67，接近人骨钙磷比值，涂层后天然陶瓷化骨Ca、P比无明显变化（图3）。(a)(b)图2陶瓷化骨的X线衍射图谱。（a）天然陶瓷化骨；（b）表面涂层陶瓷化骨(a)(b)图3陶瓷化骨的能谱分析。（a）天然陶瓷化骨；（b）表面涂层陶瓷化骨-33-的表面结构和孔隙率SEM观察发现，TBC呈现天然的高密度孔隙网架结构，骨小梁、小梁间隙和骨内管腔系统同时存在，壁厚50～260µm，孔径300～500µm，涂层后陶瓷化骨表面可见颗粒附着；高倍镜下表面涂层陶瓷化骨颗粒团聚明显，表面可见团聚颗粒（见图4）。(a)(b)(c)(d)图4陶瓷化骨形貌的SEM观察。（a）天然陶瓷化骨，×50；（b）涂层陶瓷化骨，×100；（c）天然陶瓷化骨，×2000；（d）涂层陶瓷化，×20002.4改性陶瓷化骨的生物学评价2.4.1倒置显微镜观察骨髓悬液培养早期以造血成分为主，随着换液次数增多，血系细胞基本消除，出现了长梭形外观的骨髓基质细胞，两周左右细胞基本长满。诱导后细胞与改性陶瓷化骨联合培养48小时后，可见改性陶瓷化骨周边细胞增多，并与改性陶瓷化骨附着，不易脱落，细胞由接种时的圆、椭圆形变为长梭或多角形，并伸出长的突起（图5）。图5诱导后细胞在陶瓷化骨上培养的光学显微镜观察（×100）2.4.2扫描电镜观察陶瓷化骨与细胞联合培养3天后，其上可见细胞附着生长，但分布不均，贴近培养瓶底部一侧细胞较多。细胞沿微孔生长，伸出较多的树枝状突起，其边角开始伸展而未见边角翘起和反褶。细胞呈多角形、矮柱形及长梭形，部分可见细胞遮盖微孔间隙，涂层陶瓷化骨细胞伸展、生长明显优于天然陶瓷化骨。联合培养6-34-天后部分区域可见多角、星形细胞连接成单层可见重叠生长，附着与载体孔壁相互连接，细胞间通过伪足接触融合，互相形成网状，可见细胞间有部分重叠生长，并分泌大量条索状胶原纤维并向孔内生长，涂层陶瓷化骨胶原多于天然陶瓷化骨（图6）；(a)(b)(c)(d)图6诱导后细胞在陶瓷化骨上培养的扫描电镜观察。（a）涂层TBC联合培养3d；（b）天然TBC联合培养3d；（c）涂层TBC联合培养6d；（d）天然TBC联合培养6d2.4.3ALP活性检测各组ALP活性检测见表。经t检验，2、4、6及8天陶瓷化骨和改性陶瓷化骨ALP分泌量均有显著性差异（P0.01）。表1ALP活性检测（U/ml,n=6,x±s）分组2d4d6d8d陶瓷化骨1.2±0.211.6±0.312.3±0.153.8±0.35涂层陶瓷化骨1.8±0.17*2.4±0.12*3.2±0.32*5.3±0.19*注：*P0.01。3讨论陶瓷化骨多由松质骨煅烧而来，其成分为精细结晶状态HA，与正常骨组织成分相似。它具有原骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，保留了天然骨的连续多孔结构，其微孔大小和形状，具有人工合成材料难以相比的天然网孔结构，解决了化学合成人工骨的孔隙率、孔隙连通、孔径大小等方面的制作难题。天然的三维多孔结构，有利于细胞的植入与贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出，有利于传