荧光素&流式技术.ppt

荧光素&流式细胞术杨培2014.02.11荧光素介绍流式细胞术基本原理流式细胞术的应用流式胞内因子的流式检测流式多色Panel设计主要内容一.荧光素介绍荧光素（Fluorescein）是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多。荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。荧光素介绍荧光素的激发和发射光谱•任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）•激发光谱（Excitation，Ex）：–是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。–吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max•发射光谱（Emission）：–是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光–发射波峰（最大发射波长）：Em-Max•荧光素的使用：–选择正确的激光器–确定所需荧光探测器（PMT）488nm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）荧光素介绍•Blue（488nm）–FITC–AlexaFluor488–PE–PerCP–PerCP-Cy5.5–PE-Cy5–PE-Cy7–PI–7-AAD•Red（633nm）–APC–APC-Cy7–AF647–AF700•Violet（405nm）–AmCyan–BrilliantViolet421–PacificBlue–BrilliantViolet510–BrilliantViolet570–BrilliantViolet605–BrilliantViolet650–BrilliantViolet711–BrilliantViolet785–Qdot605•UV(360nm）–DAPI常用荧光素荧光素介绍第二步：荧光素的选择荧光素光谱分析网络工具：荧光素介绍Alexa488Alexa488合成的有机物AlexaFluors,Cydyes,Horizon,Dylight,etc蛋白PE,APC,GFP,mCherry半导体纳米Qdots,Crystalplex,eFluorNC有机聚合物BrilliantVioletAlexa488PECy5Cy5Cy5荧光素家族CollisionalQuenching荧光素淬灭耦合荧光素耦合荧光素M1M1anti-MouseCD3e,clone145-2C11-PE/Cy5BioLegendCompetitor1耦合荧光素不同厂家，抗体荧光强度不同：F:P值不同耦合荧光素对光、对固定剂更敏感BrilliantVioletTM570BrilliantVioletTM605BrilliantVioletTM650BrilliantVioletTM711BrilliantVioletTM785耦合荧光素家族PE-Cy7BrilliantViolentTM简称“BV”，是诺贝尔奖获得者发明的“最新一代”的荧光染料，“BV”染料是有机聚合物，它有很强的光吸收能力（消光系数）和光转换能力（量子产率），这些物理特性使“BV”的亮度很强，更适合弱表达蛋白的检测。BrilliantViolentTM荧光素家族，包括：BV421，BV510,BV570，BV605，BV650，BV711，BV785七个成员，充分利用流式细胞仪405nm激发管，与其它各种荧光素兼容性好。Biolegend公司可以提供最新最全的BV系列荧光抗体，BD目前只推出了四种！BrilliantVioletTM荧光素家族荧光素荧光强度激发光滤光片平行荧光素BrilliantVioletTM4215405nm450/50PacificBlueBrilliantVioletTM5104405nm510/50或525/50BDHorizon™V500和AmCyanBrilliantVioletTM5703405nm585/40PacificOrangeBrilliantVioletTM6055405nm605/12或510/20eFluor®605和Qdot®605BrilliantVioletTM6504405nm660/20eFluor®650和Qdot®650BrilliantVioletTM7114405nm710/50eFluor®700NC和Qdot®705BrilliantVioletTM7853405nm780/60Qdot®800荧光强度。（检测灵敏度及联接蛋白数量）吸收光谱宽窄。（多色染色时不易漏光）光稳定性。（光漂白）Buffer稳定性。（PH值稳定）机器兼容性。（激发光与接收光是否与大众化的机器相匹配）荧光素评价指标发射波长(nm)530580630680730780FITCPEPE-TRPE-CY5不同荧光素发射波长及波长宽窄不同荧光素评价指标--荧光发射波长荧光素评价指标--荧光强弱二.流式细胞术基本原理流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种以流式细胞仪为检测手段，可以快速、准确、客观，同时检测单个生物微粒的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。特点:研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、人工合成微球等快速、准确、高通量检测多参数、多色荧光分析，对细胞特性的识别、计数更为准确定性或定量分析细胞分选特定性状或功能的细胞流式细胞术原理液流系统光学系统电子系统分选系统流式细胞仪的基本结构流式细胞仪-光学系统前向角散射光（FSC）：反映相对大小侧向角散射光（SSC）：反映细胞粒度及细胞内相对复杂性前向角检测器FSCLaser测向角检测器sSC激光光源信号检测—散射光信号外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）白细胞淋巴细胞单核细胞粒细胞根据散射光信号从人白细胞中鉴别出不同亚群：信号检测—荧光素荧光信号CD3-FITCCD19-PEPI-Fluorescence#Evnts正常G0/G1期细胞•直方图(Histogram)•二维点图(DotPlot)•三维图（3DPlot）等直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)凋亡细胞峰•等高线图(ContourPlot)•密度图(Density)流式数据三维图（3DPlot）流式细胞术常用分析软件BDcellquestBDFacsDiva。。。仪器自带分析软件第三方分析软件三.流式细胞术的应用流式技术的应用流式技术的应用流式检测技术：了解细胞的特征•细胞亚群•细胞表型•细胞粘附分子•细胞因子受体•细胞胞内因子•细胞周期四.流式胞内因子的流式检测胞内检测(ICFCorICS)?胞内检测指标主要包括：细胞因子—胞浆转录因子—细胞核细胞内抗原或细胞内结构标志物信号分子,如：活化的蛋白激酶胞内流式检测操作表面指标检测固定/破膜胞内指标检测活化细胞细胞因子阻断5.201.8137.53.921.0360.8IL-17IFN-γ流式细胞因子检测检测的细胞：是否分泌目标细胞因子适合的细胞活化方法分泌细胞因子的阻断：阻断剂的添加与选择固定，破膜：固定/破膜试剂的选择尽量选择强荧光素抗体检测死细胞的去除细胞因子流式检测，需要考虑的因素：细胞活化细胞活化的一般方法：PMA/Ionomycin,PHA/ConA模拟体内活化方法：MHC(抗原),TCR(CD3±CD28),细胞因子(IL-2,IFN-r)，LPS细胞活化的protocols：分泌细胞因子的阻断细胞因子表达后快速分泌，如果不进行阻断，则细胞内因子含量很低，无法检测.阻断剂包括:BrefeldinA(#420601)Monensin(#420701)阻断剂对细胞有一定毒性，与细胞接触的时间越短越好(2-24h)。+BrefeldinA+Monensin细胞的固定与破膜固定:多聚甲醛(PFA)•浓度,时间,温度(例如.2%PFA,4C,10-15min)•与荧光素，细胞表面指标兼容•终止液：stainingbuffer+BSA•BioLegendFixationBuffer(#420801)破膜:皂素(0.05-0.2%)•其他破膜剂(MeOH,Tween20,TritonX-100)•后续步骤都需要破膜剂:•洗涤步骤•抗体孵育•BioLegendPermeabilizationWashBuffer(#421002)胞内因子与细胞核内指标检测，需选择不同的固定破膜剂！！核内指标染色:FoxP3TReg细胞鉴定：CD4+CD25+FoxP3+BALB/cmousesplenocytesstainedwithMouseTregFlow™Kit(FOXP3AlexaFluor®488/CD4APC/CD25PE)核内指标检测，需要破双层膜，固定/破膜剂不同于胞内指标使用的试剂！FOXP3Fix/PermBuffer(4x)(#421401)FOXP3PermBuffer(10x)(#421402)如何节约您的时间？胞内检测流程:需要大约1天表面指标检测固定/破膜胞内指标检测刺激活化细胞活化固定破膜检测•表面+胞内指标•室温孵育抗体优于4°C•检测指标下调如：CD4BioLegendFixationbuffer(#420801)Cyto-LastBuffer(#422501)4°C可保存至2周哪些步骤可以保存及暂停实验？固定/破膜后染色检测需注意！固定/破膜对表面指标的影响：Krutziketal.JI2005五.流式多色Panel设计带有不同荧光素的细胞细胞表面受体针对细胞不同蛋白的标记不同荧光素单克隆抗体细胞与多种抗体共孵育流式多色检测概述1.1.多个激发光，滤光片，PMT2.选择多种流式试剂更加准确区分某一特定细胞群多种参数，获得更多信息省时，省钱，省标本有助于发更好的文章流式多色检测的优势Th1随着科学的发展，细胞的标记在不断发现，数量在不断增加！所以在区分某一特定细胞群时,需要更多的细胞标记。需要功能强大的流式细胞仪荧光素选择更加困难补偿难调节流式多色检测的难点流式多色Panel设计第一步：了解您的流式仪器配置型号,激发光，探测器，滤光片第二步：荧光素与流式仪器相匹配第三步：检测指标与荧光素相匹配第四步：查找&订购商业的荧光素抗体流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及分析型流式，科研临床领域都涉及分析型流式，有几种型号，临床领域为主Attune分析型流式，科研领域为主分析型流式，科研领域为主第一步：了解您的流式仪器配置FACSCalibur单激光三色，或双激光四色，市场覆盖率最高，分析型FACSCanto双激光六色，分析型FACSAria双激光六色，或三激光八色，分选型为主，也可以分析FACSLSR双激光六色，三激光八色，或者更多激光，分析型最高配FACSInflux激光多个，高端分选型BD流式细胞仪CantoⅡandARIAtypical光路图488nm405nm633nm检测器组（激光器）PMT位置长通透镜带通/长通透镜适用染料八角形A735780/60PE-Cy7（488nm蓝色激光）B655670LPPerCP-Cy5.5PerCPC610空白可选框-D556585/42PEE502530/30FITCF空白可选框488/10SSCG空白可选框空白可选框-H空白可选框空白可选框-三角形A502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）B空白540/50PacificBlue,BV421三角形A735780/60APC-Cy7（633nm红色激光）B685空白可选框C空白660/20APCBDCantoⅡ光路参数例如：检测器组（激光器）PMT位置长通透镜带通/长通透镜适用染料八角形A735780/60PE-Cy7（488nm蓝色激光）B655670LPPerCP-Cy5.5PerCPC610空白可选框-D556585/42PEE502530/30FITCF空白可