体外试验中医药膳血清样品制备的实践经验体会

!#$年第%卷第#!期&&中西医结合护理!中英文&&&&&&&&&!#$%#%$#!#!#$%&’()*+,-*./+’0./12’01).)*0#34)*/(/0*15/(./’*6/1)7)*/&&89-$#$##’’$:*).7;$!#$#!+!论著!体外试验中医药膳血清样品制备的实践经验体会廖巧静!杨&柳!谭景予!福建中医药大学护理学院#福建福州#%(#!!摘要含药血清是探讨药膳作用机制体外试验的主要干预手段-本文从实践国家自然科学基金课题*从2L*:%A))N信号通路探讨芪药鸡金粥调控()K[所致胃肠黏膜损伤肠道紧密连接蛋白表达的机制+!编号,#*%**+的体外试验#积累*芪药鸡金粥+含药血清样品制备保存的经验#现从动物准备.给药方案.采血时机.血清灭活储存等方面进行报道#旨在为将来在中医护理领域中从事相关研究的科研工作者提供参考与借鉴-关键词中医药膳’含药血清’体外试验’中医护理’药理机制中图分类号T!!,&&文献标志码4&&文章编号!’+G,+$!!#$#!G!%G*收稿日期!#$)##)#基金项目国家自然科学基金青年科学基金项目!,#*%**+通信作者谭景予#QGM9E@$^EC?G:7J9Cm0JM9E@P0M.3#,%#)$#41,#&,%)/E#6%$&-#614462+#,*E+&E’#%)7%-,4#3#,%E#)-@;=R%&4B%)/##FG@%*##MFA%)/P*#!A8#--3-,K0&.126#O091%2L214$&.1(*-,D&%’1(1-2%3E#12$.$F$’1812$#O0#-0#O091%2#%(#!!L!MIHM$24/H’/H0’0.)*,/1)70./1(/’&)(*/,.4/O/DH’7/1&’/(,’/MH#’)*+/740*)((,/1)70./1,1)*B).’/MH/’)/*.$F0(/1*.4/%0.)*0#%0.&’0#=7)/*7/A&*C10.)*H’@/7./*.).#/1*Q,,/7.,/1)70./1,1S)T0X)X)*U4&,’2)+4.X&*7.)*?’./)*()*(CAK)*1&7/1I0(.’)*./(.)*0#6&7().)($#/,2L*:%AC)F?0.4;0D+!%$,#*%**+$24)(H0H/’(&0’)J/1.4//MH/’)/*7/,H’/H0’)*+/1)70./1,1C(/’&(0H#/)*B).’/MH/’)/*.$A)B/0(H/7.(;/’/)*.’1&7/1)*.4)(H0H/’#)*7#&1)*+.4/(/#/7.)*,0*)0#(#)1/*.),)70.)*,1(0+/’/+)/*#)1/*.),)70.)*,0HH’H’)0./.)/H)*.,’.0O)*+N#1(0H#)*+#)*07.)B0.)*0*1(.’0+/,(/’&0*1(.&1D#)).0.)*(0*1)H#)70.)*($24)(H0H/’)*./*1/1.H’B)1/(/)H#)70.)*(,’’/(/0’74/’(;40’/)*./’/(./1)*())#0’’/(/0’74.H)7()*.4/0’/0(,.’01).)*0#/1)7)*/*&’()*+$N.C=IJ!$.’01).)*0#34)*/(//1)70./1,1’/1)70./1(/’&’)*B).’(.&1)/(’.’01).)*0#34)*/(//1)7)*0#*&’()*+’H40’07#+)70#/740*)(&&中医药膳兼具药.食双重功效#操作方法简单方便#口感适宜#依从性高的特点-前期的系列临床研究(#)!)已证实中医药膳的有效性#在此研究的基础上#现开始通过基础实验研究(%)()#探讨其作用机制-含药血清是区别于中药粗提物作为药物源的体外试验#具体指的是采用灌胃方法将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物含药血清#用此含有药物成分的血清作为药物源加入离体反应系统中从而研究其药理作用的一种半体内试验方法(+)#即也称血清药理学试验-它是研究药理机制最常见的试验方法之一($)#但其制备保存过程是否恰当#决定了含药血清中有效成分的活性及含量#这些都直接影响体外试验的结果-当前关于含药血清样品的制备已有众多的研究(+)$)#但仍有多个环节存在争议#也还在探索过程-本研究基于国家自然科学基金课题*从%%!%中西医结合护理!中英文!#$年第%卷第#!期2L*:%A))N信号通路探讨芪药鸡金粥调控()K[所致胃肠黏膜损伤肠道紧密连接蛋白表达的机制+!编号,#*%**+体外试验#在实践中积累含药血清制备保存的一些经验#现从动物准备.给药方案.采血时机.血清灭活储存等方面进行报道#以便为将来在中医护理领域中从事相应的研究者提供参考与借鉴-UV材料与方法##&材料于福州大学生物科学与工程学院实验室和福建中医药大学实验动物中心进行+只WOK级ZEFJ98健康成年雄性大鼠含药血清样品制备实验-#!&方法#!#&动物准备#!##&动物的选择与编码$选择WOK级ZEFJG98大鼠作为制备含药血清的试验动物-试验前为了便于辨别.观察并记录每只动物的变化情况#采用棉签蘸取(q!#*#+)三硝基苯酚!苦味酸染色剂对每只大鼠进行编码标记#遵循从左到右#先上后下的原则(,)#即大鼠左前腿上为##左后腿为!#头部为%#右前腿为*#右后腿为(#在大鼠身体的不同部位的皮毛进行涂抹.区分-试验过程中注意观察标记是否模糊淡化#视情况补画-#!#!&动物捉持方法$大鼠的攻击性较强易伤人#捉持时可先带上手套以防受伤-本试验固定大鼠的方法为右手捏住大鼠尾巴放在鼠笼或粗糙物上面#将鼠尾轻轻提拉起来#左手捏住大鼠头部和背部皮肤将其固定-#!!&给药方案#!!#&给药剂量$参照徐叔云教授主编的2药理实验方法学3(’)#*人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表+中人与大鼠的等效剂量比值(+换算#每日应以#!(?rM/生药的浓度即芪药鸡金粥药液按#M/rV?体质量的常规剂量灌胃-为探讨药膳芪药鸡金粥不同剂量与相关指标变化间的量效关系#设置了高剂量.常规剂量.低剂量%个药膳组#常规药膳组灌胃剂量为#M/rV?#常规药膳组的!倍!!M/rV?视为高剂量#常规药膳组的#r!倍!(M/rV?视为低剂量#空白对照组以’q生理盐水#M/rV?代替-#!!!&给药途径$采用灌胃方法进行给药-左手固定大鼠#保证其头颈平直#右手拿着备有灌胃针头的注射器#从口角进入口腔#用灌胃管压住大鼠头部#使口腔与食管成一平面#再轻轻将灌胃针顺着上颚壁插入食道-如大鼠安静#呼吸无异常#再将药粥或’q生理盐水注入#如遇阻力#应将针管退出后再插#以免穿破食管或误入气管导致大鼠死亡-#!!%&给药时间$各组大鼠每隔#!灌胃#次#!次rB#连续%B#第*天禁食!不禁水#!后一次性灌服全天剂量-#!%&采血取样第*天大鼠禁食!不禁水#!后一次性灌服全天剂量##后用质量浓度!q#即!M/r#?体质量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(#)#参照车兆义等(##)报道方法腹主动脉取血于负压采血管中#每只大鼠取!管血#每管约*M/-#!*&血清灭活.储存选择水浴灭活的方法#将血清放置于(+s水浴中灭活+MEC#过滤除菌后冻存管分装#置于)!s冰箱内贮存备用-#!(&其他动物试验过程中动作轻柔#能减少实验动物的恐惧.躁动和攻击#促使试验顺利进行#增加实验结果的可靠性(#!)-本试验共使用ZEFJ98级大鼠+只#虽然大鼠性情凶猛#但研究过程中善待动物如抓取大鼠做操作时方法得当#态度温和#动作轻柔’当大鼠表现出不安.烦躁时#通过抚摸的动作对其适当地进行*心理安抚+以使其舒适’试验结束无#例发生攻击实验者并受损事件-WV结果实验过程顺利#成功制备含药血清样品#未出现大鼠灌胃.麻醉死亡并受损事件-XV讨论%#&动物选择%##&生物学特性相近物种体外试验时应尽量选择与人类生物学特性近似的物种#以降低或减免种属间血清在理化.生物等特性上的不同#避免排斥反应#从而增加试验的可信度(+##%)#*)-大鼠.豚鼠.家兔与人类血清成分相近#是目前中药血清药理学试验中用来制备含药血清的常用动物(#()-本课题体外试验干预对象是人结肠癌肿瘤细胞!;9P0)!细胞#结合本课题研究的目的#本课题采用WOK级ZEFJ98大%*!%_0@%#I0#!#!#$I78FEC?0DSCJ2?89J2B=89BEJE0C9@;EC2F29CBZ2FJ28C62BEPEC2鼠作为制备芪药鸡金粥含药血清的试验动物-%#!&病理与生理动物模型的选择制备含药血清选择正常的动物模型还是病理性动物模型#是目前血清药理学试验的争议点-有些学者认为病理模型制备的含药血清比正常动物制备的含药血清更能反映药物的真实疗效(#+)-但也有不同的观点#采用病理模型药物制作的含药血清虽能代表药物在疾病机体内的生物转化过程#但是生物转化过程中含药血清的有效成分作用于靶器官达到治疗效果的时候#会被*消耗+#而且被消耗的程度未可知(#()-综合考虑#结合当前此类研究仍以正常实验动物为多($)#所以本试验最终采用正常的大鼠#未对大鼠进行病理性造模-本研究将根据后期试验结果#进一步探讨是否需要采用病理状态下的试验动物进行制备含药血清-%!&给药剂量当前公认的给药剂量方法有两种$方法一是给药剂量i临床用药量p动物等效剂量系数!按体表面积p培养基内血清稀释度#是血清药理学试验中最为常用和成熟的办法-方法二是血清冻干粉法#主要损耗血清中水分#使得培养基内药物浓度与血药浓度达到*等浓+状态#如在培养体系中加入*血清冻干粉+相当于添加#q的含药血清(#$)#与体外细胞培养的血清浓度应限制在!q以下的要求出现不符($)-因此#本试验采用第一种剂量给药方法#其能避免含药血清在体外反应系统被培养液稀释的缺点#防止产生假阳性或阴性的实验结果-但缺点是血药浓度不一定能与给药剂量呈比例增加#即当血药浓度达到一定浓度后#给药剂量加倍#血药浓度不一定加倍’此外给药剂量不能无限制地增加#要考虑动物的耐受能力和大剂量将造成的毒性反应(+)-这也是本试验高.中.低剂量芪药鸡金粥含药血清设置的局限性-采取剂量的选择#可通过预实验来解决(#,)-%%&给药及采血时机李仪奎等(#’)通过对(!(种中药药物进行动力学参数分析后#提出一种通用的给药方案$每日给药!次!每#!灌胃给药#次#持续%B给药#最后#次给药后#后采集血液样品-吴健宇等(!)研究结果也表明多次给药!每日剂量分!次服#连续给药%B#第*天#次服用全天剂量的药物血清药效优于单次给药的药物血清-’+个药物达峰时间分析结果显示#达峰时间-#的有*!个!*%,q’#k!的有*+个!*$’q’n!的有,个!,%q(!#)-给动物灌胃%B或(B或#周或#B#然后禁食水#于给药后#或!取血制备血清#目前被认为是合理的做法(!!)-本试验采用李仪奎提出的给药采血时机通法方案(#’)-这种方案采集血清样品#可节省预试验过程#但不能否定#也会有一些药物成分采取时因血药浓度不在血药浓度高峰期而使实验出现阴性结果-这是本试验可能存在的问题-%*&血清灭活%储存血清灭活这一常规处理方法是必要的(!%)-未灭活的血清中含有细胞因子.酶.补体.抗体及其它生物活性物质#血清灭活可避免血清非药理性干扰#并且符合降低微生物感染的常规细胞培养规范(!*)-血清灭活常用的方法有丙酮法.乙醇法.放置(+s水浴中灭活%MEC(!()-本研究采用的是水浴灭活的方法-参考文献(#)&陈锦秀#王雅青#骆惠玉#等黄蓣粥防治胃癌化疗胃肠道反应的疗效研究(H)国际护理学杂志#!,#!$!#$#+#)#+!(!)&王雅青黄蓣粥对胃癌化疗患者胃肠道反应的干预研究(5)福州$福建中医学院#!$(%)&汪玉洁芪药鸡金粥对()K[腹腔注射大鼠肠