DxI800培训--DxI原理及定标

DxI800原理概述概述DxI800是目前世界上最先进，效率最高的全自动化学发光分析仪用于多种体液微量物质的定量、半定量以及定性试验采用顺磁性颗粒，碱性磷酸酶激发的AMPPD，RV穿梭系统，试剂盒覆膜技术等分析技术的关键点分析模式检测技术分离技术免疫标记物发展放射性同位素(Radioisotopes)-RIA优秀的灵敏度，抗干扰能力好效期短，重现性差，手工操作，分析时间长，污染物的处理等荧光素(Fluorophores)-FIA稳定，较好的灵敏度和重现性其它荧光物的干扰，线性范围窄酶(Enzymes)-EIA非常容易使用对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现化学发光物质-CLEIA优秀的灵敏度和宽线性，抗干扰能力好类型–闪烁型(flash)，辉光型(glow)稳定性依据分子结构会有不同表现试剂效期开瓶效期定标周期目前常见的免疫分析发光物质鲁米那：1928年，早期开发的发光标记物吖啶酯：直接化学发光，闪烁型吖啶甲酰胺：直接化学发光，闪烁型三联吡啶钌：电化学发光，闪烁型AMPPD：酶促化学发光，辉光型AMPPD化学发光系统+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3OO-OOCH3为什么Beckman采用AMPPD3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）为什么Beckman采用AMPPDP.A.Boninietal.“Immunoassaysystems”标记物类型标记物名称可达到的检测限（/L）放射性同位素3H5x10-15mole125I5x10-17mole酶Beta-galactosidase1.5x10-16moleHorseradishperoxidase3x10-16moleAlkalinephosphatase5x10-17mole生物发光Fireflyluciferin/luciferase5.6x10-16photons/min/mgEnzymeenhanced10-19moleFireflyluciferin/luciferase10-19mole荧光Europium(III)ion2x10-17moleFluorescein10-13mole酶/chemiluminescencePeroxidase/luminol/enhancer10-15moleGlucose-6-phosphatedehydrogenasepeoxidase/10-18moleisoluminol*AMPPD10-21mole时间发光信号辉光坪区闪光尖峰为什么Beckman采用AMPPDAMMPPD良好的辉光特性，发光稳定时间可达1小时，检测方便稳定。磁微粒子直径0.08+/-0.02mm，接触面积大快速的反应动力学较少的样品量提高检测的灵敏度极好的批内重现性可以探针取放，实现自动化有磁性磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系分析物在磁颗粒表面捕获磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒重新悬浮十分容易清洗QSDisp#1MagAsp#1MixDisp#2MagAsp#2MixDisp#3MagAsp#3MixAddSubIncu-bateRead4minutes10x1sec.6minutes分析模式分析模式-有很多种方式可定义为分析的“处方”设定一个最优化的模式(可变量)去最优化项目的临床应用分析模式的变化可变量夹心法(Sandwich)vs.竞争法(competitive)标记物的放置同步(Simultaneous)vs.分步(sequential)试剂/样品加入的顺序孵育的次数(步骤)清洗分离的次数(步骤)试剂/样品的体积/浓度孵育的时间孵育的温度DxI800的分析模式基本分析模式夹心法(Sandwich)竞争结合(Competitivebinding)试剂的加入同步(Simultaneous)(1步,1次清洗)分步(Sequential)(2步,2次清洗)“Piggyback”(2步,1次清洗)夹心法分析模式捕捉抗体(Captureantibody)和标记抗体(labeledantibody)每个抗体的存在可以与更多的分析物发生反应分析更可靠,精确,准确和可重现性分析更灵敏因为所有分析物都参与反应每个抗体的不同可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇分析更特异因为二个抗体同时反应适合与检测大分子物质，分子量大有更多的特异性抗原决定簇可选择bhCGhTSHIgEProlactinhFSHhLHFerritinTnI一步三明治法两步三明治法夹心法定标RLU随浓度增加而增加SIGNALCONCENTRATIONLoglinearscale竞争法分析模式只有捕捉抗体主要针对小分子物质检测没有足够表面积的分析物去符合“夹心法”要求一定量的捕捉抗体使得反应复合物为只是“抽样性”反应时间较短T3FT3B12DigoxinProgesteroneT4FT4FolateCortisolEstradiol一步竞争法两步竞争法两步竞争法（标记抗体）两步竞争法（标记抗体）竞争法定标RLU随浓度增加而降低标准品–参比物USP–(UnitedStatesPharmacopia)小分子物质，如，类固醇激素，药物等质谱分析(massspectrometry)并标准化WHO–世界卫生组织大分子物质，如，蛋白质/多肽等标准品(Pool)制备，送近20参比实验用免疫学技术进行符值标准品一直分派到全部用完，后重新制备1stIRP，2ndIRP，3dIRP内部(In-house)参比物定标方式厂家产生的主定标曲线感觉节省的校正型2点定标会增加定标的频率对非线性的标准曲线可能会有问题(大多数的免疫分析产生的是非线性的标准曲线)多点定标曲线定量–典型的是6个水平,定性–典型的是2个水平可以达到最大的灵敏度,准确性和精密度可以有更长的定标周期间隔DxI800拟合定标曲线数学模型加权4参数逻辑曲线（4PLC）加权拐点平滑样条加权非拐点平滑样条直线速率定标接受过程每个定标点重复做2次或更多，获取RLU值DxI800用前述数学模型拟合数据点系统尝试通过调整曲线参数，最小化数据点到曲线的距离。如果尝试次数超过预设仍无法确定曲线，定标失败如果所有定标测试中有2个或2个以上点有致命旗标，定标也失败有些测试还要考察S0的CV系统利用数据点到获得的曲线距离以及曲线的形状，在曲线两侧计算出浓度接受范围如果任何一个数据点计算浓度超出浓度范围，定标失败1、X轴：分析物浓度；2、Y轴：RLUs3、误差区4、响应精度5、浓度精度曲线类型一条有效定标曲线总是向上或向下DxI800定标分类定量多点定标，曲线，上行/下行，通过生成曲线可将相对光单位RLU转化为浓度。测试结果为数值型。半定量多点定标，曲线，RLU转化为数值型报告，可以将数值结果以定性形式报告定性定标提供cutoff值，每个测试RLU与cutoff值比较，分层报告。定标报告定标数据评估根据APF协议系统决定定标是否通过定标失败处理如果定标数据不满足APF协议要求，将报失败。寻找定标失败原因是解决问题的关键。常见定标失败原因定标液次序放反。使用错误批号的定标液。定标液或试剂处理不当，或失效。仪器未执行日常保养发生系统错误。定标液试剂仪器定标失败代码BadFit（拟合错误）曲线无法满足APF中预设的接受限。可能的原因有，精度不足，曲线太平或太陡CVStd0（标准0的CV错误）S0的CV值不能满足APF中的预设接受限InsuffData（数据不足）两个或两个以上定标数据点没有数据，导致定标数据不足。常见原因是定标液少或仪器错误导致测试没有进行下去。Limits（范围限制）某个浓度任一RLU重复或RLU平均值超过APF预设范围。仅用于定性试验。MaxIter（叠代次数限制）系统通过叠代计算建立曲线，叠代次数限制为100次。NoFit（没有拟合）系统无法拟合出曲线。原因可能是出现违反数学运算规则的情况，比如出现0作除数，求负数的对数等。RespDelta（重复差值）整个定标数据点中，RLU最大的和最小的差值过小。RLUDose0NoValue“NoValue”ResultsforS0orS5TypicallyonereplicateoftheSOcalibratorforsandwichassayswillgive“novalue”asaresult(MayhappenatS5also)ThisdoesnotmeanthereplicatewasbadThesoftwaresimplydoesnotassignvalues0orS5案例1定标失败代码：InsuffData原因分析InsuffData意味着定标缺少至少两个定标数据点数据点缺乏常见原因为定标液不足，或由于系统错误导致某些定标测试被取消。观察本案例定标数据，发现没有S5的数据。经查，S5定标液遗漏案例2定标错误代码：NoFit分析1、NOFIT意味系统无法拟合出曲线，原因常见于违反运算法则。对于nofit案例，首先观察曲线的形状是否符合预计的形状，比如此案例铁蛋白应为平滑上升曲线，但实际所有的点都近乎在一个平面。2、检查定标点的RLU。发现所有的点都在6000左右。说明根本没有发生反应。3、检查试剂，发现试剂不足。案例3定标失败代码：Badfit；没有旗标、报警分析1、badfit的原因是曲线无法满足接受限2、观察曲线形状，正常。各水平RLU值，基本符合。但是定标点CV值明显太大，应为导致badfit原因3、运行systemcheck。发现mean偏低，CV增大4、检查发现底物管道破裂，导致气泡。WashedMean–4920()%CV–15.19()SubstrateMean–4579()%CV–8.21()Ratio–0.99UnwashedMean–3713543()%CV–6.57()试剂、定标液严格按照说明书要求进行贮存。有些定标液需要复溶。混匀试剂要注意：轻轻倒转混匀，勿产生气泡，不要适用涡旋混匀器。不要用除霜冰箱进行保存。底物易污染S0不含该物质的小牛血清非常容易受底物和缓冲液质量的影响何时需要定标定标曲线过期新批号试剂QC失控重要部件维修/更换结果标注致命性错误（FatalError）不会报告结果非致命性错误（Non-fatalError）仅标明测试进行的情况，结果仍然报告常见致命性结果标注AEX：吸取的样本已经过期，通常由于耗材缺乏引起。处理：重新加载样本，如果测试请求仍为requested，直接编号标本装载即可；如果测试请求已经被cancelled，重新编程。CLT：样本堵塞。处理：清洁样品针，和四根试剂针；重新加载样本，如果测试请求仍为requested，直接编号标本装载即可；如果测试请求已经被cancelled，重新编程。IDN：RLU结果太低（夹心法）或太低/太高（竞争法），无法和系统误差区别。处理：检查日志，看是否同时有报警。检查试剂盒，重新运行标本。QNS：样本量不足。处理：检查日志，是否有报警。重新运行标本QSB：底物分配错误。处理：重新底物四次。重新检测。SYS：发生设备错误。处理：排除硬件错误，咨询callcenter。TRI、TRS：孵育器、底物温度错误。处理：关闭仪器盖子，等待温度恢复。如果无效，咨询callcenter。常见非致命性结果标注CEX：定标曲线过期。EXS：底物过期。LEX：试剂批号过期。OVR:结果超过最高浓度定标液浓度。PEX：试剂超过开瓶稳定期。RFX：结果来自反射试验。TRR：试剂舱温度超限。处理：检查仪器温度，等待温度恢复。如果无效，咨询CallCenter。谢谢！