东方伊萨酵母FJ-J-3发酵特性的研究

ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ２０17Vol.36Ｎｏ．12ＳｅｒｉａｌＮｏ．310生物乙醇是一种可再生的清洁能源，受到人们广泛的关注。但酵母的耐受性决定着乙醇产量和生产效率[1]。乙醇对酵母细胞存在很大毒害作用[2]，同时在发酵的过程中不断增加的乙醇所产生的压力也是限制乙醇生产和最终阻止乙醇发酵的重要因素[3]。乙醇含量为60g/L的情况下，季也蒙有孢汉逊酵母被完全抑制[4]；乙醇含量120g/L的情况下，日本清酒酵母被完全抑制[5]；张强等[6]在研究酿酒酵母的乙醇耐受性的结果表明，室温条件下培养基中培养48h，其中能在30～60g/L乙醇含量条件下生长的菌株，乙醇耐受性为差，60～100g/L为耐受性中等，而100～130g/L则为耐受性高。酵母的温度耐受性是乙醇产量的基本保障，温度的变化会引起酵母细胞内的脂肪酸、磷脂、麦角固醇等成分的变化，从而影响细胞本身正常生理活动[7]。温度越高越易引起酵母早衰、死亡，同时高温也增加了乙醇对酵母细胞的毒害作用[8]。甜酒酿发酵不是一种微生物单独起作用，实际上是多种菌群的混合发酵，发酵过程中存在菌相的变化[9-10]。近年来，已有学者开始了东方伊萨酵母（Issatchenkiaorientalis）的研究，覃香香等[11]发现，东方伊萨酵母能降解木糖醇发酵抑制物；张慕明等[12]证实，东方伊萨酵母YP-1对活性艳红K-2BP有较好的脱色作用；TONDEET等[13]得出结论，东方伊萨酵母SF9-246对废水有脱色作用。王风芹等[14]新分离一株耐高温东方伊萨酵母HN-1，探究出其乙醇产量较高；KWONYJ等[15]新分离出一株耐热东方伊萨（Issatchenkiaorientalis）IPE100，探究其在不同甜高粱茎秆固态发酵（solidstatefermentation，SSF）时的产乙醇量，并证实其有相应的酶水解木质纤维素[16]。本实验利用从甜酒酿中分离出一株东方伊萨酵母FJ-J-3，研究该菌株在培养基不同初始葡萄糖含量和不同培养温度条件下的发酵特性，为该菌株的进一步利用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂[17]东方伊萨酵母（Issatchenkiaorientalis）FJ-J-3：分离自甜酒酿。酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，自然pH，115℃灭菌15min。YPD固体培养基：YPD培养基中加入琼脂20g/L。1.2仪器与设备GC-2010气相色谱仪（配氢火焰离子检测器（flameionizationdetector，FID）检测器、微机工作站及色谱柱）：日本岛津公司。GN-9080隔水式恒温培养箱：上海精宏实东方伊萨酵母FJ-J-3发酵特性的研究姚淑敏，徐凯峰，宋晴晴，陈珊，王萍（曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165）摘要：该实验研究了东方伊萨酵母（Issatchenkiaorientalis）FJ-J-3菌株在不同初始葡萄糖含量、培养温度条件下细胞生长、葡萄糖利用及产乙醇情况。结果表明，在培养基中含有50g/L葡萄糖时菌体生长量较高，生长速率最快；且乙醇产量较高，产率最高。在培养温度为28℃时菌体生长量最高，且乙醇产量最高。菌株FJ-J-3能够耐受16%vol的乙醇，且在72h时细胞仍能正常存活。关键词：纯种发酵；东方伊萨酵母；酿酒酵母；生长特性；初始培养条件中图分类号：Q935文章编号：0254-5071（20１7）1２-0092-04doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.019YAOShumin,XUKaifeng,SONGQingqing,CHENShan,WANGPing(CollegeofLifeScience,QufuNormalUniversity,Qufu273165,China)Thecellgrowth,glucoseutilizationandethanolproductionofIssatchenkiaorientalisFJ-J-3werestudiedattheconditionsofdifferentinitialglucosecontentsandculturetemperatures.ResultsshowedthatI.orientalisgrewwellandthegrowthratewasthefastestinthemediumcontainingglucose50g/L,andtheethanolproductionandproductiveratewerethehighest.Attheconditionofculturetemperature28℃,thecellgrowthandtheethanolproductionwerethehighest.TheethanoltoleranceofstrainFJ-J-3wasgood;itcouldtolerate16%volethanolandgrewwellfor72h.purefermentation;Issatchenkiaorientalis;Saccharomycescerevisiae;growthcharacteristics;initialculturecondition收稿日期：2017-07-15基金项目：国家青年科学基金项目（31200400）；曲阜师范大学本科科研训练项目作者简介：姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向为微生物资源和利用。ResearchReport92··2018-01-3115:30:08中国酿造２０17年第36卷第12期总第310期验设备有限公司；HNY-2102c恒温培养振荡器：天津欧诺仪器股份有限公司；H.H.S-214B电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂；H2050R台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-5500可见光分光光度计：上海元析仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。1.3方法1.3.1菌种活化[4]挑取一环菌株FJ-J-3，接种在含有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃、170r/min培养36h，离心去上清，将菌体用无菌水洗涤2次，最后悬于2mL无菌水中，作为种子液。1.3.2不同初始葡萄糖含量对菌株FJ-J-3生长的影响分别取0.3mL种子液接种于葡萄糖含量为20g/L、50g/L、80g/L、120g/L、150g/L的YPD液体培养基中，在28℃、170r/min条件下培养，每隔6h取样，测定菌株FJ-J-3的生长情况、葡萄糖利用量、乙醇产生情况。1.3.3不同培养温度对FJ-J-3生长的影响分别取0.3mL种子液分别接种于5组相同的YPD液体培养基中，分别在温度为25℃、28℃、33℃、37℃、42℃的条件下170r/min摇床培养，每隔12h取样，测定菌株FJ-J-3的生长情况、葡萄糖利用量、乙醇产生情况。1.3.4菌株FJ-J-3的乙醇耐受性取0.3mL种子液分别接种于乙醇含量为0、40g/L、80g/L、120g/L、160g/L、200g/L的YPD液体培养基中28℃、170r/min条件下培养，每隔12h取样，测定菌株FJ-J-3的生长情况和死活细胞数。1.3.5测定方法菌体生长情况测定：利用分光光度计法，在波长600nm处测定吸光度值。葡萄糖含量的测定：按照参考文献[18]的方法测定。乙醇产量的测定：按照参考文献[19]的方法测定。菌体的比生长速率=OD600nm值/初始葡萄糖含量降糖率=剩余糖的量/时间乙醇产率=乙醇产量/初始葡萄糖含量×100%2结果与分析2.1不同初始葡萄糖含量对菌株FJ-J-3生长的影响从图1可看出，当培养基中初始葡萄糖含量为20g/L时，细胞生长量偏低，最大OD600nm值为17.77。初始葡萄糖含量为50g/L时，培养40h时菌体浓度达到最大，OD600nm值为26.065。初始葡萄糖含量为80g/L时OD600nm值最大为23.9，比初始葡萄糖含量50g/L时低。当培养基中葡萄糖含量为120g/L和150g/L时，细胞的最大生长量OD600nm值分别为31.73和33.74，但此时菌体的比生长速率从初始葡萄糖含量50g/L时的536h-1下降至265h-1和224h-1，因此，培养基中添加50g/L的葡萄糖是YPD培养基的最佳含糖量。由图2可知，培养至40h时初始葡萄糖含量50g/L的培养基中残留葡萄糖已经接近为零，降糖率达到0.125g/（L·h），其细胞生长也接近稳定期。而在初始葡萄糖含量120g/L、150g/L的培养基中，40h时培养基中细胞的降糖率分别为0.015g/（L·h）和0.016g/（L·h）。这说明5%的葡萄糖含量是细胞生长最佳浓度，高浓度的葡萄糖会对酵母菌的生长有抑制作用。由图3可知，初始葡萄糖含量为150g/L时，培养40h图2不同初始葡萄糖含量对菌株FJ-J-3利用葡萄糖的影响Fig.2EffectsofdifferentinitialglucoseconcentrationsonglucoseutilizationofstrainFJ-J-3图1不同初始葡萄糖含量条件下FJ-J-3菌株的生长曲线Fig.1GrowthcurveofstrainFJ-J-3atdifferentinitialglucoseconcentrations研究报告图3不同初始葡萄糖含量对菌株FJ-J-3乙醇产量的影响Fig.3EffectsofdifferentinitialglucoseconcentrationsonethanolproductionofstrainFJ-J-393··ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ２０17Vol.36Ｎｏ．12ＳｅｒｉａｌＮｏ．310时所产的乙醇量达到最大值0.027mL/mL，其乙醇产率为18%。而在初始葡萄糖含量为50g/L时，菌株在40h时乙醇量达到最大为0.026mL/mL，其产率为52%。由此可见东方伊萨酵母FJ-J-3在低浓度葡萄糖含量的情况下的乙醇产率高于高含量葡萄糖培养条件。从图1～图3可以看出，菌株FJ-J-3在培养基中含有50g/L葡萄糖时菌体生长量较高，生长速率最快；且乙醇产量较高，产率最高。因此在后续实验中选择培养基中葡萄糖含量为50g/L。2.2不同培养温度对菌株FJ-J-3生长的影响由图4可知，培养温度在28℃时酵母菌FJ-J-3的生长状况最好。随着培养温度的升高，菌株的生长状况明显下降，当培养温度达到42℃时，细胞生长严重受到影响，由此可以推测菌株FJ-J-3不能耐受高温，28℃是最适生长温度。由图5可知，28℃时葡萄糖消耗的速度最快，这与28℃时细胞生长状况最好相对应。在28℃时菌株FJ-J-3在24h时菌体浓度达到最大，其利用糖的量也达到最大，所以残留的糖接近与零。由图6可知，菌株FJ-J-3的产乙醇量在不同的温度梯度下不同，28℃时产乙醇量最多，42℃时产乙醇量最小，这与其生长状况及糖的利用相对应。从图4～图6可以看出，菌株FJ-J-3在培养温度为28℃时菌体生长量最高，且乙醇产量最高。因此选择培养温度为28℃。2.3菌株FJ-J-3的乙醇耐受性由图7可知，菌株F