SNT 2206.5-2009 化妆品中微生物检验方法 第5部分肠球菌

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２０６．５—２００９化妆品微生物检验方法第５部分：肠球菌犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犻狀犮狅狊犿犲狋犻犮狊—犘犪狉狋５：犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮犻２００９０２２０发布２００９０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言ＳＮ／Ｔ２２０６《化妆品微生物检验方法》分为以下部分：———第１部分：沙门氏菌；———第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；———第３部分：肺炎克雷伯氏菌；———第４部分：链球菌；———第５部分：肠球菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２２０６的第５部分。本部分的附录Ｂ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ和附录Ｄ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：杨捷琳、顾鸣、袁辰刚、李晓虹、朱海。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２０６．５—２００９化妆品微生物检验方法第５部分：肠球菌１　范围ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分规定了化妆品中肠球菌的检验方法。本部分适用于化妆品中肠球菌的检验。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ７９１８．１　化妆品微生物标准检验方法　总则３　术语和定义下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分。３．１肠球菌　犈狀狋犲狉狅犮狅犮犮犻一类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽孢和荚膜，可分解胆汗七叶苷。４　材料和设备４．１　振荡器。４．２　三角瓶：２５０ｍＬ。４．３　玻璃珠。４．４　玻璃棒。４．５　刻度吸管：１ｍＬ，１０ｍＬ。４．６　均质器。４．７　恒温培养箱３６℃±１℃，４６℃±１℃，３２．５℃±２．５℃。４．８　天平：感量为０．００１ｇ。４．９　高压灭菌器。５　培养基和试剂５．１　Ｄ／Ｅ中和培养基（Ｄｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和培养基），参见附录Ａ第Ａ．１章。５．２　叠氮化钠葡萄糖肉汤，参见附录Ａ第Ａ．２章。５．３　ＫＦ培养基（加中和剂），参见附录Ａ第Ａ．３章。５．４　Ｐｆｉｚｅｒ肠球菌选择性琼脂（ＰＳＥ琼脂），参见附录Ａ第Ａ．４章。５．５　３％过氧化氢溶液。５．６　革兰氏染色液。５．７　６．５％氯化钠葡萄糖琼脂，参见附录Ａ第Ａ．５章。１犛犖／犜２２０６．５—２００９６　检验程序６．１　化妆品中肠球菌ＭＰＮ计数法检验流程图见图１。图１　化妆品中肠球菌犕犘犖计数法检验流程图６．２　化妆品中肠球菌平板计数法流程图见图２。图２　化妆品中肠球菌平板计数法流程图６．３　样品制备样品按照ＧＢ／Ｔ７９１８．１供检样品的制备方法进行。样品制备时，也可参见附录Ａ第Ａ．１章的Ｄ／Ｅ中和培养基代替生理盐水或ＳＣＤＬＰ培养基。参见附录Ｃ中列出的化妆品中常用防腐剂种类及微生物检测时所使用的中和剂种类和配方，可根据不同产品成分参照使用。２犛犖／犜２２０６．５—２００９６．４　最大近似数（犕犘犖）法６．４．１　用适当稀释的样液接种叠氮化钠葡萄糖肉汤管，每个稀释度接种３管，接种量为１ｍＬ或１ｍＬ以下时，使用１０ｍＬ单料管；接种量为１０ｍＬ时，使用１０ｍＬ双料管，接种后的试管置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，检查各试管浑浊情况，若浑浊不明显，继续培养至４８ｈ后记录。６．４．２　培养２４ｈ±２ｈ或４８ｈ±２ｈ后，对所有呈现浑浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤管进行确证，用接种环将各管培养物划线于Ｐｆｉｚｅｒ肠球菌选择性琼脂（ＰＳＥ琼脂）平板或ＫＦ琼脂平板，倒置于３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。肠球菌属细菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落，在ＫＦ平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐；对典型或可疑菌落至少挑取１０个按６．６进行确证实验。每管培养物中有一个菌落确认为肠球菌，则该管视为阳性。６．４．３　结果报告：根据接种的样品量和确证为肠球菌的管数，查ＭＰＮ表（见附录Ｂ），报告每克（毫升）［ｇ（ｍＬ）］样品中肠球菌的ＭＰＮ值。６．５　平板计数法６．５．１　取１ｍＬ适当稀释的检液加入９０ｍｍ×１５ｍｍ的培养皿内，倾注１２ｍＬ～１５ｍＬ已融化约４５℃的ＫＦ琼脂或ＰＳＥ琼脂培养基，转动培养皿使培养基与样液混匀，待平板凝固后倒置于３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，每个稀释度接种两块平板。６．５．２　菌落形态：肠球菌在ＫＦ琼脂平板上形成暗红色至粉红色菌落，在ＰＳＥ琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落为典型或可疑菌落。６．５．３　菌落计数及结果报告：对典型或可疑菌落挑取１０个按６．６进行确证实验。选取２５个～２５０个确证为肠球菌菌落的平板进行计数，计算同一稀释度两个平板的平均菌落数，报告结果。６．６　确证实验６．６．１　革兰氏染色：挑取上述可疑菌落，染色镜检，肠球菌为革兰氏阳性球菌，多数成双或呈短链状排列，无芽孢。６．６．２　过氧化氢酶实验：挑取固体培养基上典型或可疑菌落，置于洁净试管内，或涂于干净的载玻片上，然后分别滴加３％过氧化氢溶液２ｍＬ或一滴观察结果，于０．５ｍｉｎ内产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性，肠球菌为过氧化氢酶阴性。６．６．３　６．５％氯化钠葡萄糖培养：挑取单菌落接种６．５％氯化钠葡萄糖琼脂培养基，３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，观察是否生长。过氧化氢酶实验和６．５％氯化钠葡萄糖实验生长符合者判定为肠球菌属，可参照附录Ｄ进行进一步确证和分类。７　中和剂验证７．１　微生物菌株采用粪肠球菌（ＡＴＣＣ４９４５２）或其他等同性菌株。７．２　验证实验７．２．１　接种物的制备在测试前，用粪肠球菌（ＡＴＣＣ４９４５２）接种ＫＦ琼脂培养基，３２．５℃±２．５℃培养１８ｈ～２４ｈ。收集培养物，调整悬液浓度为１０８ＣＦＵ／ｍＬ。注：在２ｈ内使用制备的悬液和稀释液。７．２．２　梯度稀释菌悬液，以获得１００ＣＦＵ／ｍＬ与５００ＣＦＵ／ｍＬ之间的浓度。为了计数调整的菌悬液中的活菌数量，移取１ｍＬ悬液放入平皿内，混皿法倾注平板，倒置３２．５℃±２．５℃培养２０ｈ～２４ｈ计数。７．２．３　取样品１ｇ或１ｍＬ，按照ＧＢ／Ｔ７９１８．１供检样品的方法１∶１０制备样液，无菌方式加入０．１ｍＬ调整好浓度的菌悬液，未添加细菌的样品作为对照。７．２．４　划线分离于添加中和剂（ＫＦ＋）和未添加中和剂（ＫＦ－）的ＫＦ平板，３２．５℃±２．５℃培养３犛犖／犜２２０６．５—２００９２０ｈ～２４ｈ。７．３　验证结果的解释如果ＫＦ（＋）平板上有标准菌株生长，在ＫＦ（－）平板上不生长，中和剂的中和效果得以验证。当ＫＦ（＋）和ＫＦ（－）上均有细菌生长，如果ＫＦ（＋）生长菌株为添加的标准菌株时，中和剂和中和效果得以验证。在ＫＦ（＋）和ＫＦ（－）无细菌生长或仅ＫＦ（－）有杂菌生长均表明抗菌活性仍然存在，应改变样品与培养基稀释比例，或改变中和剂配方，进一步选择合适的中和剂配方，验证中和效果。４犛犖／犜２２０６．５—２００９附　录　犃（资料性附录）培养基犃．１　犇／犈中和培养基（犇犲狔／犈狀犵犾犲狔中和培养基）犃．１．１　成分葡萄糖１０．０ｇ大豆磷脂７．０ｇ五水硫代硫酸钠６．０ｇ聚山梨醇酯８０８０５．０ｇ胰化酪蛋白５．０ｇ亚硫酸氢钠２．５ｇ酵母膏２．５ｇβ巯基乙醇１．０ｇ溴甲酚紫０．０２ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．３±０．１犃．１．２　制法将各组分依次称取加入，加热后使之完全溶解，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，使用时，调节ｐＨ值至７．６±０．２。犃．２　叠氮化钠葡萄糖肉汤犃．２．１　成分牛肉浸膏４．５ｇ胰蛋白胨１５．０ｇ葡萄糖７．５ｇ氯化钠７．５ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．２犃．２．２　制法以上各成分混匀，不断加热搅拌溶解，用适当大小试管分装，每管１０ｍＬ，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，若制备双料浓度，上述配方中蒸馏水改为５００ｍＬ。犃．３　犓犉培养基（加中和剂）犃．３．１　成分三号胨或多胨１０．０ｇ酵母浸膏１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ甘油磷酸钠１０．０ｇ５犛犖／犜２２０６．５—２００９麦芽糖２０．０ｇ乳糖１．０ｇ叠氮化钠０．４ｇ琼脂２０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ卵磷脂１ｇＴｗｅｅｎ８０７ｇｐＨ７．０±０．２犃．３．２　制法将各成分加热溶解，用１０％碳酸钠调整ｐＨ值至７．２，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～６０℃时加入无菌１％氯化三苯四氮唑（２，３，５ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）水溶液１０ｍＬ。培养基于４５℃～５０℃倾注平板，凝固后保存于冰箱备用。犃．４　犘犳犻狕犲狉肠球菌选择性琼脂（犘犛犈琼脂）犃．４．１　成分蛋白胨２０．０ｇ酵母浸膏５．０ｇ细菌学用胆汁１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ柠檬酸钠１．０ｇ七叶苷（Ｅｓｃｕｌｉｎ）１．０ｇ柠檬酸铁铵０．５ｇ叠氮化钠０．２５ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．４．２　制法１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，灭菌后ｐＨ７．１，冷却后倾注平板。犃．５　６．５％氯化钠葡萄糖琼脂犃．５．１　成分胰蛋白胨１０．０ｇ酵母浸膏１．５ｇ葡萄糖１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ溴甲酚紫０．０１５ｇ琼脂１５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．５．２　制法各成分溶解后，调节ｐＨ值为７．０，分装于１３ｍｍ×１３０ｍｍ试管，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，斜置试管使成斜面。６犛犖／犜２２０６．５—２００９附　录　犅（规范性附录）犕犘犖表犅．１　１犵样品中最可能数（犕犘犖）表使用三管法，接种量为０．１，０．０１，０．００１（ｍＬ），见表Ｂ．１。表犅．１　犕犘犖表阳　性　管　数０．１０．０１０．００１ＭＰＮ０００＜３０００３００２６００３９０１０３０１１６．１０１２９．２０１３１２０２０６．２０２１９．３０２２１２０２３１６０３０９．４０３１１３０３２１６０３３１９１００３．６１０１７．２１０２１１１１２１５１１０７．３１１１１１１１２１５１１３１９１２０１１１２１１５１２２２０１２３２４７犛犖／犜２２０６．５—２００９表犅．１（续）阳　性　管　数０．１０．０１０．００１ＭＰＮ１３０１６１３１２０１３２２４１３３２９２００９．１２０１１４２０２２０２０３２６２１０１５２１１２０２１２２７２１３３４２２０２１２２１２８２２２３５２２３４２２３０２９２３１３６２３２４４２３３５３３００２３３０１３９３０２６４３０３９５３１０４３３１１７５３１２１２０３１３１６０３２０９３３２１１５０３２２２１０３２３２９０３３０２４０３３１４６０３３２１１００３３３＞１１００　　注：表内所列样品量如改为１，０．１，０．０１ｇ（ｍＬ）时，表内数字应相应降低１０倍；如改为０．０１，０．００１，０．０００１ｇ（ｍＬ）时，则表内数字相应增加１０倍，其余可类推。８犛犖／犜２２０６．５—２００９附　录　犆（资料性附录）防腐剂对应使用中和剂清单表犆．１　防腐剂对应使用中和剂清单防　腐　剂中　和　剂中和剂及漂洗液配方（膜过滤法）　酚类化合物　对羟基苯甲酸酯，　苯基乙醇，　苯胺　卵磷脂，聚山梨醇酯８０，脂肪酸环氧乙烷聚合物，非离子型表面活性剂　聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。　脂肪酸环氧乙烷聚合物，７ｇ／Ｌ＋卵磷脂，２０ｇ／Ｌ＋聚山梨醇酯８０，４ｇ／Ｌ。　Ｄ／Ｅ中和培养基ａ　漂洗液：蒸馏水；蛋白胨，１ｇ／Ｌ＋氯化钠，９ｇ／Ｌ；聚山梨醇酯８０，５ｇ／Ｌ。　季胺类化合物，阳离子表面活性剂　卵磷脂，皂角苷，聚山梨醇酯８０，十二烷基硫酸钠，脂肪酸环氧乙烷聚合物　聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋十二烷基硫酸钠，４ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。　聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋皂角苷，３０ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。　Ｄ／Ｅ中和培养基ａ　漂洗液：蒸馏水；蛋白胨，１ｇ／Ｌ＋氯化钠，９ｇ／Ｌ；聚山梨醇酯８０，５ｇ／Ｌ。　甲醛　乙醛　甘氨酸，组氨酸　卵磷脂，３ｇ／Ｌ＋聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋Ｌ组氨酸，１ｇ／Ｌ。　聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋皂角苷，３０ｇ／Ｌ＋