SNT 2099-2008 进出口食品中绿脓杆菌检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０９９—２００８进出口食品中绿脓杆菌检测方法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋２００８０７１７发布２００９０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前　　言本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：郑晶、黄晓蓉、赵贵明、翁国柱、吴芸芸、郑麟毅、陈彬、邵碧英。本标准系首次发布的出入境检验检疫标准。Ⅰ犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网进出口食品中绿脓杆菌检测方法１　范围本标准规定了食品中绿脓杆菌的定性和定量检测方法。本标准适用于各类食品中的绿脓杆菌检测，可参考此法检测水的绿脓杆菌。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３　食品微生物学检验　染色法、培养基和试剂ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１绿脓杆菌属假单胞菌属（狆狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊）亦名为铜绿假单胞菌，具荚膜、鞭毛，为无芽胞的革兰氏阴性杆菌，能分解蛋白质，发酵糖类能力较低，能产生两种水溶性色素：一种是绿脓菌素，为蓝绿色的吩嗪类化合物，无荧光性，另一种为荧光素，呈绿色。４　设备和材料４．１　恒温培养箱：３６℃±１℃、４２℃。４．２　显微镜：带油镜头。４．３　均质器。４．４　高压灭菌器。４．５　天平：精度０．１ｇ。４．６　ＶＩＴＥＫ全自动微生物鉴定系统或类似设备。注：ＶＩＴＥＫ是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。４．７　吸管：１ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ；１０ｍＬ，分刻度１ｍＬ。４．８　可调移液器：１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ。４．９　试管：１５ｍｍ×１００ｍｍ。４．１０　灭菌平皿：直径９０ｍｍ，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。４．１１　灭菌的样品处理器具：镊子、剪刀、勺子。４．１２　质控菌株：绿脓杆菌标准菌株ＡＴＣＣ９０２７，恶臭假单胞菌ＡＴＣＣ４９１２８或其他经过验证的具有相同生物学特征的同类菌株。５　培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的规定。５．１　ＳＣＤＬＰ增菌液：见第Ａ．１章。５．２　磷酸盐缓冲稀释液：见第Ａ．２章。１犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网５．３　假单胞菌ＣＦＣ选择性培养基：见第Ａ．３章。５．４　假单胞菌ＣＮ选择性培养基：见第Ａ．４章。５．５　氧化酶试验：按ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３中３．１８规定。５．６　乙酰胺培养基：见第Ａ．５章。５．７　葡萄糖酸盐培养基：见第Ａ．６章。５．８　精氨酸双水解酶培养基：见第Ａ．７章。５．９　硝酸盐蛋白胨水培养基：见第Ａ．８章。５．１０　明胶培养基：见第Ａ．９章。５．１１　赖氨酸脱羧酶培养基；见第Ａ．１０章。５．１２　营养琼脂：见第Ａ．１１章。５．１３　ＡＰＩ２０ＮＥ测试条。５．１４　ＧＮＩ＋测试卡。注：ＡＰＩ２０ＮＥ测试条和ＧＮＩ＋测试卡是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。６　检验程序６．１　方法提要食品中绿脓杆菌的检验方法是通过选择性增菌、分离、生化鉴定等方法对食品中可能存在的绿脓杆菌进行定性和定量的检验。６．２　检验程序绿脓杆菌的检验程序见图１。图１　绿脓杆菌检验程序示意图２犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网７　检验步骤７．１　样品的存放如为冷冻样品，应于２℃～５℃解冻，且不超过１８ｈ，若不能及时检验，应置于小于－１５℃保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于４℃冰箱保存，并在２４ｈ内检验。７．２　绿脓杆菌定性检验７．２．１　按无菌操作取检样２５ｇ（２５ｍＬ）至２２５ｍＬＳＣＤＬＰ增菌液中，充分摇匀，于３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。７．２．２　接种ＳＣＤＬＰ增菌培养物按７．４进行分离鉴定。７．３　绿脓杆菌定量检验（犕犘犖法）７．３．１　无菌操作取样品２５ｇ（２５ｍＬ），放入灭菌均质杯或均质袋中，加２２５ｍＬ灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲稀释液，均质混匀，制成１∶１０稀释液。７．３．２　用１０ｍＬ灭菌吸管吸取１∶１０稀释液１０ｍＬ，加入装有９０ｍＬ灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲稀释液的广口瓶中，混合均匀，制成１∶１００稀释液。７．３．３　每一稀释度换取一支１０ｍＬ灭菌吸管，按上述操作进行１０倍递增稀释。７．３．４　根据对样品污染情况的估计，选择三个连续适宜的稀释度。每个稀释度接种三管ＳＣＤＬＰ肉汤，每管接种１ｍＬ。样品的最高稀释度应达到能获得阴性终点，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。如有绿脓杆菌生长，培养液表面通常有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。７．４　分离鉴定７．４．１　分离培养每份增菌液用接种环分别划线接种于ＣＦＣ平板和ＣＮ平板，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，观察菌落形态。绿脓杆菌在这两种平板上通常呈现圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，在紫外光照射下可观察到荧光。少数不形成黄绿色菌落，但有特殊芳香气味。从每个平板上挑取５个可疑菌落，分别接种到营养琼脂斜面上，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ，取纯培养物进行鉴定。７．４．２　氧化酶试验挑取斜面上的纯培养物，按ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３中３．１８进行氧化酶试验，绿脓杆菌氧化酶试验呈阳性。７．４．３　革兰氏染色挑取斜面上的纯培养物，按ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３中２．２进行革兰氏染色，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌。７．４．４　鉴定革兰氏染色阴性、氧化酶阳性的培养物应用ＡＰＩ２０ＮＥ测试条、ＶＩＴＥＫ生化鉴定系统或按７．４．５～７．４．１１进行生化鉴定。７．４．５　乙酰胺试验挑取斜面上的纯培养物，接种到乙酰胺培养基中，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，培养基不变色为阴性，红色为阳性。７．４．６　葡萄糖酸盐试验挑取斜面上的纯培养物，接种到葡萄糖酸盐培养基中，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，加０．５ｍＬ班氏糖定性试剂，混匀，煮沸１ｍｉｎ，冷却后观察。蓝色为阴性，黄色或砖红色沉淀为阳性。７．４．７　精氨酸双水解酶试验挑取斜面上的纯培养物，接种到精氨酸双水解酶培养基中，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，培养基不变色为阴性，红色为阳性。３犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网７．４．８　硝酸盐还原产气试验挑取斜面上的纯培养物，接种到硝酸盐还原胨水培养基中，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，小倒管中有气体者，即为阳性。７．４．９　明胶液化试验挑取斜面上的纯培养物，穿刺接种到明胶培养基中，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，取出放２℃～８℃冰箱１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，仍呈溶解状为明胶液化试验阳性，凝固不溶为阴性。７．４．１０　赖氨酸脱羧酶试验挑取斜面上的纯培养物，接种到赖氨酸脱羧酶培养基中，置３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ，黄色为阴性，紫红色为阳性。７．４．１１　４２℃生长试验挑取斜面上的纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在４２℃培养２４ｈ～４８ｈ，能生长为阳性。７．４．１２　假单胞菌属细菌生化特性特性见表１。表１　假单胞菌属细菌生化特性生化试验绿脓杆菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌施氏假单胞菌氧化酶＋＋－－乙酰胺＋－－－葡萄糖酸盐＋－－－精氨酸双水解酶＋＋＋＋硝酸盐还原产气＋－－＋明胶液化＋－－－赖氨酸脱羧酶－＋－－４２℃生长＋－－－　　注：＋表示阳性；－表示阴性。７．５　结果报告７．５．１　定性检验结果报告：符合表１中生化特性，或ＡＰＩ２０ＮＥ和ＶＩＴＥＫ生化鉴定为绿脓杆菌，报告样品中是否检出绿脓杆菌。７．５．２　定量检验结果报告：符合表１中生化特性，或ＡＰＩ２０ＮＥ和ＶＩＴＥＫ生化鉴定为绿脓杆菌，根据每一稀释度的阳性管数差ＭＰＮ表（见附录Ｂ），计算并报告每克（毫升）样品中绿脓杆菌ＭＰＮ值。４犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网附　录　犃（规范性附录）培　养　基犃．１　犛犆犇犔犘液体培养基犃．１．１　成分酪蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　１７．０ｇ大豆蛋白胨３．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钾２．５ｇ葡萄糖２．５ｇ卵磷脂１．０ｇ吐温８０７．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．２±０．１犃．１．２　制法将上述各成分加热煮沸至完全溶解，调节ｐＨ，分装适宜容器，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ。犃．２　磷酸盐缓冲稀释液犃．２．１　贮存液犃．２．１．１　成分磷酸二氢钾３４．０ｇ蒸馏水５００ｍＬ犃．２．１．２　制法用大约１７５ｍＬ的１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液调节ｐＨ至７．２，用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ后贮存于冰箱中。犃．２．２　稀释液用蒸馏水稀释１．２５ｍＬ贮存液至１０００ｍＬ，分装于适宜容器，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．３　假单胞菌犆犉犆选择性培养基犃．３．１　基础培养基犃．３．１．１　成分蛋白胨２０．０ｇ硫酸钾１０．０ｇ氯化镁１．４ｇ十六烷三甲基溴化胺０．３ｇ琼脂１３．６ｇ丙三醇１０ｍＬ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．２±０．２５犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网犃．３．１．２　制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节ｐＨ，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．３．２　犆犉犆添加剂犃．３．２．１　成分十六烷三甲基溴化胺　　　　　　　　５．０ｍｇ头孢菌素２５．０ｍｇ夫西地酸５．０ｍｇ犃．３．２．２　制法取无菌水和无水乙醇各１ｍＬ混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。犃．３．３　使用方法待基础培养基冷却至５０℃左右，每５００ｍＬ基础培养基加入２ｍＬ添加剂，倾注无菌平板。犃．４　假单胞菌犆犖选择性培养基犃．４．１　基础培养基犃．４．１．１　成分蛋白胨１６．０ｇ水解酪蛋白１０．０ｇ硫酸钾１０．０ｇ氯化镁１．４ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．１±０．２犃．４．１．２　制法除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节ｐＨ，加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．４．２　犆犖添加剂犃．４．２．１　成分十六烷三甲基溴化胺１００．０ｍｇ犃．４．２．２　制法取无菌水和无水乙醇各１ｍＬ混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。犃．４．３　使用方法待基础培养基冷却至５０℃左右，每５００ｍＬ基础培养基加入２ｍＬ添加剂，摇匀后倾注平板。犃．５　乙酰胺培养基犃．５．１　成分乙酰胺９．５ｇ氯化钠４．５ｇ磷酸氢二钾１．４ｇ磷酸二氢钾０．７ｇ硫酸镁０．３ｇ酚红０．０１２ｇ蒸馏水１０００ｍＬ６犛犖／犜２０９９—２００８食品伙伴网ｐＨ７．２±０．１犃．５．２　制法将上述各成分加热溶解，调节ｐＨ，分装小试管，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ，备用。犃．６　葡萄糖酸盐培养基犃．６．１　成分蛋白胨１５ｇ酵母粉１０ｇ磷酸氢二钾１０ｇ葡萄糖酸钾４００ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ６．８～７．２犃．６．２　制法将上述各成分加热溶解，调节ｐＨ，分装小试管，１１６℃高压灭菌２０ｍｉｎ，备用。犃．７　精氨酸双水解酶培养基犃．７．１　成分酵母粉３．０ｇ葡萄糖１．０ｇ