SNT 2869.2-2011 植物种质资源鉴定方法 第2部分 中草药青蒿的鉴定

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６９．２—２０１１植物种质资源鉴定方法第２部分：中草药青蒿的鉴定犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犵犲狉犿狆犾犪狊犿狉犲狊狅狌狉犮犲狊犻狀狆犾犪狀狋—犘犪狉狋２：犃狉狋犲犿犻狊犻犪犪狀狀狌犪犔．２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２８６９《植物种质资源鉴定方法》共分为两部分：———第１部分：斑点野生稻的鉴定；———第２部分：中草药青蒿的鉴定。本部分为ＳＮ／Ｔ２８６９的第２部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本部分主要起草人：徐涛、朱水芳、许瑾、赵文军、张舒亚、梁成珠、岳志芹、郑小龙、吴志毅、陈洪俊。Ⅰ犛犖／犜２８６９．２—２０１１植物种质资源鉴定方法第２部分：中草药青蒿的鉴定１　范围ＳＮ／Ｔ２８６９的本部分规定了进出境中草药青蒿植物资源鉴定的方法。本部分适用于国家法律法规规定禁止出口或重点保护的青蒿物种及其遗传材料的出（过）境检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１４０７２　林木种质资源保存原则与方法ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求ＡＳＴＭＥ１３４２　用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒、遗传要素以及动物和植物组织的保存（Ｓｔａｎｄａｒｄｐｒａｃｔｉｃｅｆｏｒｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｂｙｆｒｅｅｚｉｎｇ，ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｉｎｇ，ａｎｄｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆ犫犪犮狋犲狉犻犪，犳狌狀犵犻，ｐｒｏｔｉｓｔａ，ｖｉｒｕｓｅｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｅｌｅｍｅｎｔｓ，ａｎｄａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１种质　犵犲狉犿狆犾犪狊犿亲代通过有性生殖过程或体细胞直接传递给子代并决定固有特性的遗传物质。３．２花序　犻狀犳犾狅狉犲狊犮犲狀犮犲花在总花柄上的排列方式，花序最简单的形式是单生花，如有多朵花在花序轴上排列，则花序的类型可分为无限花序和有限花序。３．３头状花序　犮犪狆犻狋狌犾狌犿花序上各花无梗，多数花集生于一花托上，形成状如头的花序。花序轴常膨大为球形、半球形、圆锥形或盘状，花序基部常有总苞，常称篮状花序，如向日葵；有的花序下面无总苞，如喜树；也有的花轴不膨大，花集生于顶端的，如三叶草、紫云英等的花序。３．４原生质体　狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。原生质体由原生质分化形成，具体包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器，植物和动物的如细胞核、线粒体和高尔基体等；而细菌如核糖体、拟核等。１犛犖／犜２８６９．２—２０１１３．５瘦果　犪犮犺犲狀犲；犪犽犲狀犲单果类干果中的一种闭果，由单一心皮的子房发育而成，果实内仅一枚种子，种子只有一处与子房壁相接，成熟时种皮与果皮易分开。果实小形、干燥、果皮坚硬、不开裂。３．６苞片　犫狉犪犮狋在花或花序基部着生的变态叶，有保护花芽或果实的作用，是有花植物身上的一种特殊的过渡器官。按其在茎轴上的位置、排列和形态的不同，另有小苞片和总苞之别。通常把包被花或花簇的一轮苞片称为总苞，着生于花序梗上的小的苞片称为小苞片。总苞的形状和轮数为种属鉴别的特征之一。４　原理４．１　对青蒿的鉴别主要依靠传统的形态鉴别方法，只能依据成株期及花期的叶片及花序形态对青蒿加以鉴定，对种子和幼苗的鉴别尚存困难。利用电子显微镜对细微结构进行观察，主要包括孢粉学和各种表皮的微形态学。４．２　青蒿植物资源进出境时，可能存在的形态有：种子、幼苗、植株、叶片、花序、花粉、组培苗、原生质体、组织、细胞、核酸（基因组ＤＮＡ、ＲＮＡ）等。以实时荧光ＰＣＲ方法为主，并借助形态学特征和生物化学特性是制定本标准的主要依据。５　仪器和试剂５．１　仪器生物显微镜（具测量功能），体视显微镜，天平，高压灭菌器，台式高速离心机，ｐＨ计，水浴箱，荧光定量ＰＣＲ扩增仪，试管，研钵，可调移液器（１０００μＬ，２００μＬ，２０μＬ，１０μＬ，２．５μＬ），移液器吸头，离心管，液氮罐等。５．２　试剂ＰＣＲ反应常用试剂、电泳试剂和核酸分子量标准等，除另有规定外，均为分析纯或生化纯，水为按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定的执行。６　鉴定方法６．１　形态学方法鉴定对于幼苗、花、果实等材料用肉眼或借助放大镜观察形状、大小、色泽、纹理和表面结构等生物学特征进行初步鉴别。鉴定时应有标准品种的样品或标准品种的彩色图谱及描述作依据（参见附录Ａ和附录Ｂ）。６．２　分子生物学方法鉴定６．２．１　犇犖犃提取按ＣＴＡＢ方法提取ＤＮＡ，见附录Ｃ。２犛犖／犜２８６９．２—２０１１６．２．２　实时荧光犘犆犚检测青蒿的实时荧光ＰＣＲ检测方法见附录Ｃ，防污染措施应符合ＳＮ／Ｔ１１９３的规定。６．３　紫外分光光度法鉴定参见附录Ｄ。７　鉴定特征７．１　生物学特性参见附录Ａ。７．２　分子生物学特征空白对照：基因检测Ｃｔ值等于４０。阴性对照：基因检测Ｃｔ值等于４０。阳性对照：基因检测Ｃｔ值在２０～３０之间。上述指标有一项不符合者，应重做实时荧光ＰＣＲ扩增。８　结果判定实时荧光ＰＣＲ检测时，待测样品基因检测Ｃｔ值在２０～３０之间，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品为青蒿植物。成株期及花期的叶片及花序形态鉴别可参见附录Ｂ，符合的可判定为青蒿植物。青蒿中青蒿素的检测可参见附录Ｄ，符合Ｄ．６的可判定为青蒿植物。９　样品保存与复核９．１　样品保存物种资源的样品保存方法按照标准ＧＢ／Ｔ１４０７２和ＡＳＴＭＥ１３４２的规定执行。９．１．１　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的名称与编号、来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有分类鉴别的特征照片，电镜观察需有形态照片，分子生物学检测需有最终的实验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。９．２　复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时由专家对检测结果进行复核。３犛犖／犜２８６９．２—２０１１附　录　犃（资料性附录）青蒿的相关资料犃．１　分类地位英文名：Ｓｗｅｅｔｗｏｒｍｗｏｏｄ，ＳｗｅｅｔＡｎｎｉｃ学名：犃狉狋犲犿犻狊犻犪犪狀狀狌犪Ｌ．中文别名：黄花蒿、黄蒿、臭黄蒿、黄香蒿、香苦草和秋蒿等。青蒿（犃狉狋犲犿犻狊犻犪犪狀狀狌犪Ｌ．）隶属被子植物门（犃狀犵犻狅狊狆犲狉犿），木兰纲（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｓｉｄａ），菊目（Ａｓｔｃｒａｌｅｓ），菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ），春黄菊族（犃狀狋犺犲犿犻犱犻狀犪犲），蒿属（犃狉狋犲犿犻狊犻犪），蒿亚属（犃狉狋犲犿犻狊犻犪），艾蒿族（犃犫狉狅狋犪狀狌犿）。犃．２　分布范围原产于我国，全国各地均有分布，东半部省区分布在海拔１５００ｍ以下地区，西北及西南省区分布在２０００ｍ～３０００ｍ地区，西藏分布在３６５０ｍ地区；生境适应性强，东部、南部省区生长在路旁、荒地、山坡、林缘等处；其他省区还生长在草原、森林草原、干河谷、半荒漠及砾质坡地等，也见于盐渍化的土壤上，局部地区可成为植物群落的优势种或主要伴生种。现广布于欧洲、亚洲的温带、寒温带及亚热带地区，在欧洲的中部、东部、南部及亚洲北部、中部、东部最多，向南延伸分布到地中海及非洲北部，亚洲南部、西南部各国；另外还从亚洲北部迁入北美洲、并广布于加拿大及美国。黄花蒿虽然系世界广布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。据迄今的研究结果，除我国重庆东部、福建、广西、海南部分地区外，世界绝大多数地区生产的黄花蒿中的青蒿素含量都很低，无利用价值。据国家有关部门调查，在全球范围内，目前只有我国重庆酉阳地区武睦山脉生长的青蒿素才具有工业提炼价值。对这种独有的药物资源，国家有关部委从２０世纪８０年代开始就明文规定对青蒿素的原植物（青蒿）、种子、干鲜全草及青蒿素原料药一律禁止出口。犃．３　生物学特性为一年生草本植物，种子繁殖，植株具浓烈的挥发性香气。根单生，垂直，狭纺锤形。茎单生，高１００ｃｍ～２００ｃｍ，基部直径可达１ｃｍ，有纵棱，幼时绿色，后变褐色或红褐色，多分枝；茎、枝、叶两面及总苞片背面无毛或初时背面微有极疏短柔毛，后脱落无毛。叶纸质，绿色，茎下部叶宽卵形或三角状卵形，三至四回栉齿状羽状深裂，每侧有裂片５枚～８（～１０）枚，裂片长椭圆状卵形，再次分裂，小裂片边缘具多枚栉齿状三角形或长三角形的深裂齿，裂齿长１ｍｍ～２ｍｍ，宽０．５ｍｍ～１ｍｍ中肋明显，在叶面上稍隆起，叶柄长１ｃｍ～２ｃｍ，基部有半抱茎的假托叶；中部叶二（至三）回栉齿状羽状深裂，小裂片栉齿状三角形。稀少为细短狭线形，具短柄；上部叶与苞片叶一（至二）回栉齿状羽状深裂，近无柄。头状花序球形，多数，直径１．５ｍｍ～２．５ｍｍ，有短梗，下垂或倾斜，基部有线形的小苞叶，在分枝上排成总状或复总状花序，并在茎上排成开展、尖塔形的圆锥花序。总苞片３层～４层，内、外层近等长，外层总苞片长椭圆形，中肋绿色，边膜质，中层、内层总苞片宽卵形或卵形，花序托凸起，半球形；花深黄色，雌花１０朵～１８朵，花冠狭管状，檐部具２（～３）裂齿，外面有腺点，花柱线形。伸出花冠外，先端２叉，叉端钝尖；两性花１０朵～３０朵，结实或中央少数花不结实，花冠管状，花药线形，上端附属物尖，长三角形，基４犛犖／犜２８６９．２—２０１１部具短尖头，花柱近与花冠等长，先端２叉，叉端截形，有短睫毛。瘦果小，椭圆状卵形，略扁。花果期８月～１１月。犃．４　药用价值该种含挥发油，并含有一种倍半萜内脂化合物“青蒿素”（Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）、青蒿内酯Ⅰ、Ⅱ、青蒿酮、樟脑等。青蒿素分子式为Ｃ１５Ｈ２２Ｏ５，为治疗疟疾的有效成分，治各种类型疟疾，具速效、低毒的优点，对恶性疟疾及脑疟尤佳。中药习称“青蒿”，植物学通称“黄花蒿”，该种在不同生态环境中生长，其体态略有变异。入药作解热、解暑、截疟、凉血、利尿、健胃、止盗汗用，此外，还作外用药。南方民间取枝叶制酒饼或作制酱的香料。牧区作牲畜饲料。青蒿素来源主要是从黄花蒿中直接提取得到；或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成得到。从全合成的工艺复杂，成本太高；组织培养则因技术和实际应用投入产出比等原因尚不成熟。目前除黄花蒿外，尚未发现含有青蒿素的其他天然植物资源。疟疾是全球贫困国家的头号杀手疾病，每年在全球造成数亿人感病，至少２００万人死亡。由于疟原虫对氯喹等传统抗疟药的耐受性日益增强，青蒿素成为了治疗疟疾的一线用药，并且，因其具有独特的结构及药理作用，至今未发生抗药性的病例。青蒿素已被ＷＴＯ列入国际药典，这是我国第一个被国际公认的具有自主知识产权的独创新药。近年来的研究表明，青蒿素对乳腺癌细胞有明显的选择性和杀伤性，青蒿有可能成为无毒的抗癌药，人们特别希望青蒿素及其衍生物能在治疗艾滋病及相关疾病方面取得进展。５犛犖／犜２８６９．２—２０１１附　录　犅（资料性附录）青蒿幼苗、花及果实不同时期形态图图犅．１　幼苗图犅．２　花序图犅．３　瘦果图犅．４　总苞片图犅．５　干的花枝图犅．６　头状花序６犛犖／犜２８６９．２—２０１１附　录　犆（规范性附录）青蒿的实时荧光犘犆犚检测方法犆．１　犇犖犃提取方法犆．１．１　１００ｍｇ匀碎样品转移至１．５ｍＬ灭菌离心管，加５００μＬＣＴＡＢ提取液，混合溶液于６５℃孵育３０ｍｉｎ。犆．１．２　向上述反应体系中加入５００μＬＴｒｉｓ饱和苯酚／三氯甲烷／异戊醇（２５∶２４∶１），混匀。犆．１．３　４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上层液转移至另一新的１．５ｍＬ灭