SNT 2757-2011 植物线虫检测规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５７—２０１１植物线虫检测规范犚狌犾犲狊犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋狆犪狉犪狊犻狋犻犮狀犲犿犪狋狅犱犲狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准参加起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李俊环、江丽辉、顾建锋、彭金火、姜莉、姜丽、王有福、汪万春、付海滨、侯浩、闫超杰。Ⅰ犛犖／犜２７５７—２０１１植物线虫检测规范１　范围本标准规定了进出境植物线虫的检测规范。本标准适用于进出境植物及植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质中线虫的检疫鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ２７４０２　实验室质量控制规范　植物检疫ＳＮ／Ｔ１７２４　进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程ＳＮ／Ｔ１８４８　植物有害生物鉴定规范３　原理利用线虫趋水性和重力作用、浮力作用，将线虫从寄主植物、土壤或栽培介质、包装材料等中分离出来，根据形态特征，结合生物学、分子生物学等方法，判定其种类。４　仪器用具和试剂４．１　仪器生物显微镜（１００×～１０００×）、体视显微镜（１０×～８０×）、培养箱、低速离心机（１０００ｒ／ｍｉｎ～５０００ｒ／ｍｉｎ）、超净工作台、水浴锅、恒温箱、控温电热平板、胞囊漂浮器、冰箱。４．２　用具木工锯或电锯、斧头、解剖刀、解剖针、剪刀、镊子、分离筛（１０目～２０目、６０目～１００目、３２５目～４００目、５００目）、研钵、线虫滤纸、纱布、漏斗、浅盘、改进贝曼漏斗、乳胶管、夹子、吸管、烧杯、三角瓶、蒸发皿或培养皿、载玻片、盖玻片、凹玻片、酒精灯、试管、指形管、打孔器、干燥器、记号笔、毛刷、毛笔、玻璃纤维丝、自制线虫挑针。４．３　试剂４０％甲醛、三乙醇胺、甘油、冰乙酸、蔗糖溶液（４８４ｇ蔗糖：１Ｌ蒸馏水）、高岭土、石蜡、凡士林、乙醇（浓度７０％、９５％、１００％）、苦味酸、中性树胶、指甲油、阿拉伯树胶、丁香油、４５％乳酸、４０％过氧化氢、马铃薯葡萄糖琼脂、水琼脂。５　实验室检测５．１　样品的前处理５．１．１　植物组织将植物材料（根、茎、果实等）切成小段或薄片（厚度＜０．５ｃｍ），或将种子等较小的植物组织碾碎，１犛犖／犜２７５７—２０１１待测。５．１．２　土壤及栽培介质将从植物材料和运输工具上收集到的土壤或栽培介质混匀，作为待测样品。５．１．３　媒介昆虫将媒介昆虫的整体或部分虫体放入小钵中研碎，加水浸泡后直接在体视显微镜下检测。５．１．４　原木、木制品和木质包装材料将原木、木制品和木质包装材料制成小木条或木片（厚度＜０．５ｃｍ）作为待测样品。具体可参照ＳＮ／Ｔ１７２４。５．２　线虫分离线虫分离方法参见附录Ａ。根据抽取的样品类别、数量或质量，可能携带的线虫种类，选取附录Ａ中一种合适的分离方法进行分离。为提高检出率，各种分离方法可以结合使用。５．３　线虫标本制作分离获得的线虫，根据具体情况，可以制作临时玻片或永久玻片来进行线虫的鉴定。一般情况下，为快速鉴定线虫，常制作临时玻片进行观察；如需进一步观察、鉴定或检出的重要线虫种类需要长期保存时，则需要制成永久玻片。线虫玻片标本的制作方法参见附录Ｂ。５．４　线虫培养当分离到的线虫数量较少或为幼虫时，需要根据线虫种类，采用不同的培养方法培养，获得大量雌虫和雄虫，再进一步进行种类的鉴定。线虫培养方法见附录Ｃ。５．５　线虫的鉴定５．５．１　形态学鉴定线虫的形态学鉴定主要依据雌虫和雄虫的形态特征，如：线虫侧尾腺的有无，雌虫和雄虫的头部和口针的形状、食道类型、尾部形状、生殖系统的形态差异等进行鉴定。针对雌、雄虫主要鉴定特征仔细观察并显微摄影，同时在每张图片上加相应标尺。线虫的体长、体宽及虫体各个体段的长度及其比例等也是线虫鉴定的参考依据。本标准采用ＤｅＭａｎ公式，对线虫进行测计。同一性别、同一龄期的线虫个体需测量２０条以上，不足２０条的全部测量。５．５．２　其他鉴定方法采用生物学、分子生物学等方法，结合传统形态学，准确、快速鉴定线虫种类。６　结果判定及复核以形态学鉴定为主，辅以其他分类鉴定方法，判定线虫种类。对于检疫性线虫，需要按照ＧＢ／Ｔ２７４０２和ＳＮ／Ｔ１８４８的要求进行复核，复核时需提供雌虫和雄虫标本、玻片标本、图像或影像资２犛犖／犜２７５７—２０１１料等。７　记录按照ＧＢ／Ｔ２７４０２和ＳＮ／Ｔ１８４８的要求，详细记录检验过程，包括危害症状、检测方法、检测程序、检测结果、检测人员、日期等。８　样品保存８．１　样品保存对已经检出检疫性线虫的植物、植物材料、植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质等，经登记后，要保存在低温（０℃～５℃）、干燥、防虫、防鼠处，并标明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具、输出国名等，以备复验、谈判和仲裁。８．２　线虫保存结果判定后，将剩余线虫杀死、固定，制成永久玻片保存；也可固定后置于含有固定液的指形管中长期保存，并标明样品编号、制作时间及制作人等。９　无害化处理实验室检出的线虫、线虫分离液、废弃物（如：植物、植物材料、土壤或栽培介质等）、用具（分离器、烧杯等）等，根据样品种类、线虫的检出情况，采用杀死活体线虫、煮沸用具、焚烧废弃物、高压灭菌处理废弃物等方法进行无害化处理，防止有害线虫传播扩散。３犛犖／犜２７５７—２０１１附　录　犃（资料性附录）线虫分离方法犃．１　直接分离犃．１．１　直接解剖分离适用于植物组织中固着寄生线虫，如根结线虫（犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲ｓｐｐ．）、球胞囊线虫（犌犾狅犫狅犱犲狉犪ｓｐｐ．）、胞囊线虫（犎犲狋犲狉狅犱犲狉犪ｓｐｐ．）、异常珍珠线虫（犖犪犮狅犫犫狌狊犪犫犫犲狉犪狀狊）等。将洗净的植物组织放在培养皿中，加少量清水，在体视显微镜下用镊子固定住植物材料，用解剖针挑开或用镊子撕开植物材料，然后用镊子或线虫挑针将线虫从植物组织中分离出来，再用线虫挑针或者细毛笔把膨大的线虫或者蠕虫形线虫移出。但线虫大部分露于植物组织表面时，也可直接在体视镜下用解剖针轻轻剥离并挑取线虫。犃．１．２　直接浸泡分离适用于相似穿孔线虫（犚犪犱狅狆犺狅犾狌狊狊犻犿犻犾犻狊）、茎线虫（犇犻狋狔犾犲狀犮犺狌狊ｓｐｐ．）、菊花滑刃线虫（犃狆犺犲犾犲狀犮犺狅犻犱犲狊狉犻狋狕犲犿犪犫狅狊犻）等迁移性内寄生线虫的分离，也可用于研碎的媒介昆虫材料中线虫的分离。取少量植物材料或媒介昆虫材料置于培养皿中，加少量水浸泡一段时间，在体视显微镜下用线虫挑针直接挑取或用吸管吸取线虫。犃．２　贝曼漏斗分离法适用于植物、植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质等样品中迁移性线虫的分离。将漏斗（直径１０ｃｍ～１５ｃｍ）置于漏斗架上，下方接长５ｃｍ～１０ｃｍ的乳胶管，乳胶管末端夹上夹子，漏斗中注入清水。将制备的样品用２层～３层纱布包好，轻轻放入漏斗中，保持室温１５℃～２８℃，１２ｈ～２４ｈ后打开夹子，用培养皿收集乳胶管中的线虫悬浮液５ｍＬ，静置１０ｍｉｎ左右，吸去上层清水，镜检。犃．３　改进型贝曼漏斗法分离适用于植物、植物产品、土壤及栽培介质等样品中线虫的分离。改进型漏斗法分离装置，由一只较大并类似于贝曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘装置相似（见图Ａ．１）。将线虫滤纸平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待测样品放置其上；从筛盘下部的空隙中将水注入分离器中，以淹没供分离的材料为止；在约１５℃～２８℃下放置２４ｈ后，打开止水夹，用离心管接取约５ｍＬ～１０ｍＬ的水样；静置３０ｍｉｎ左右或１５００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，吸去离心管内上层清液后，即获得线虫含量较高的悬浮液。４犛犖／犜２７５７—２０１１图犃．１　改进型漏斗法分离线虫装置示意图犃．４　浅盘法分离适用于植物、植物产品、土壤及栽培介质等样品中迁移性线虫的分离。两只不锈钢浅盘，一只口径较小，底部为粗筛网。另一只口径较大，底部正常。较小的筛网套放于另一只浅盘中。将线虫滤纸（也可用擦镜纸或双层纸巾）平铺在筛网上，用水淋湿，将制备的样品均匀放在其上，从两只浅盘的夹缝中注入清水至浸没样品。保持室温１５℃～２８℃，２４ｈ后收集底盘中的线虫悬浮液，用５００目筛过滤收集线虫。犃．５　过筛法分离此法主要用于土壤样品中线虫的分离。在大小合适的容器中，将样品加水充分搅拌，使土壤中的线虫充分悬浮到泥浆中，静置１０ｓ～２０ｓ，悬浮液依次通过２０目、６０目、４００目套筛（或用１０目、１００目、４００套筛等），重复冲洗过筛三次。用喷头在筛子下方向上充分淋洗各标准筛中的残余物，细小的土粒冲掉，并除去大的砂粒、根、茎等杂物，将筛上物冲洗入小烧杯。１０目～２０目分离筛除去杂物，６０目～１００目分离筛可收集胞囊，３２５目～４００目分离筛可收集蠕虫形线虫，５００目筛可收集虫卵。犃．６　离心法分离适用于植物组织、土壤及栽培介质中大量线虫的分离。将上述样品放入烧杯或较大容器中，加适量水充分搅拌，静置片刻，将上浮液倒入离心管，加１ｍＬ～２ｍＬ粉状高岭土，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，倒掉上清液，加入蔗糖溶液，用振荡器混匀或用玻璃棒充分搅拌均匀，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，上清液倒入５００目筛子中，充分淋洗，将线５犛犖／犜２７５７—２０１１虫洗入小烧杯。犃．７　漂浮分离法犃．７．１　总则仅用于分离土壤中的胞囊。样品量１００ｇ以上用漂浮分离器分离，少于１００ｇ用简易漂浮法分离。犃．７．２　漂浮分离器将土样风干压碎，用孔径３ｍｍ的标准筛过筛，除去植物组织和沙砾等杂物。淋湿下筛，漂浮筒灌满清水，将１００ｇ过筛后的土样放入上筛，用强水流将全部土样冲洗入漂浮筒，土粒下沉，胞囊和一些较轻的杂物上浮。１ｍｉｎ～２ｍｉｎ后，由上筛加清水到漂浮筒内，筒口的胞囊和杂物经水槽流入下筛（１００目），将胞囊等筛上物冲洗至三角瓶，瓶内注入清水至瓶口，静置片刻，将漂浮物倒入漏斗中过滤，滤纸晾干后在显微镜下检测。犃．７．３　简易漂浮法待分离土样风干后，充分混匀。混匀的土样放在１０００ｍＬ三角瓶中，加水至５００ｍＬ，充分搅拌成悬浮状，然后边加水边搅动，加水直至接近瓶口处。静置１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，待土粒沉入底部，胞囊浮在水面，把上层漂浮物倒入１００目筛上，冲洗后将筛网上的收集物淋洗到铺有滤纸的小漏斗中，滤去水分，待滤纸晾干后即可在体视显微镜下观察，将滤纸上的胞囊用毛刷等夹取到另一铺有湿滤纸的培养皿中待鉴定。也可用１０％的硫酸镁溶液代替水。６犛犖／犜２７５７—２０１１附　录　犅（资料性附录）线虫标本制作方法犅．１　线虫杀死杀死少量线虫，挑取数条线虫至凹玻片中央的水滴中，将凹玻片在酒精灯火焰上移动加热５ｓ～６ｓ即可。加热时要注意观察，当弯曲的虫体突然伸直，或称“Ｃ”形及螺旋形时，立即停止加热，或用手背接触玻片，感觉稍烫手即可。杀死大量线虫时，将３ｍＬ～５ｍＬ线虫悬浮液移至试管中，在悬浮液中加入等量的沸水；或６０℃～６５℃水浴处理２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，其间不断摇动试管，均匀受热，待悬浮液冷却后立即加入固定液。犅．２　线虫固定将杀死后的线虫移至１倍固定液（参见附录Ｄ）中，或直接在悬浮液中加入等量浓度双倍的固定液。犅．３　临时玻片制作取一滴ＦＧ液于洁净载玻片中央，在体视显微镜下，用挑针挑取若干线虫至ＦＧ液中，使其下沉至浮载剂底部，并将线虫排列整齐。将３根与线虫虫体直径相近的玻璃纤维丝呈三角状均匀排列在ＦＧ液边缘，加盖玻片。用滤纸吸取溢出的溶液，用指甲油封片，待指甲油干后再加封一次，贴上标签，注明样品编号、制片时间、制片人。或将线虫沉入凹玻片的浮载剂底部，加盖玻片。可将临时玻片置于铺有潮湿滤纸的培养皿内，在４℃冰箱内或低温处保存。但活体线虫制成的临时玻片应在２４ｈ内鉴定，防止虫体变形影响观