SNT 2708-2010 猪圆环病毒病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!#%#猪圆环病毒病检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’,-’.*(+.*’.-1*’%23*2+&2+!#%#4%%4#%发布!#%%4#&4#%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、广东省农业科学院兽医研究所。本标准主要起草人：朱道中、刘中勇、刘俊平、宋长绪、蒋智勇、陶琦、陈茹、林志雄。Ⅰ犛犖／犜２７０８—２０１０猪圆环病毒病检疫技术规范１　范围本标准规定了猪圆环病毒病的病毒分离、鉴定和疫病诊断等方法的技术要求。本标准适用于猪圆环病毒病的监测、检疫、诊断和流行病学调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　缩略语下列缩略语适用于本文件。Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数ＣＰＥ：细胞病变效应ＤＮＡ：脱氧核糖核酸ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光黄ＩＦＡ：间接免疫荧光试验ＭＥＭ：最低要求培养基Ｍａｒｋｅｒ：分子量标记物ｎＰＣＲ：巢式聚合酶链式反应ＰＣＶ１：猪圆环病毒１型ＰＣＶ２：猪圆环病毒２型ＰＫ１５：猪肾传代细胞系ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ：荧光聚合酶链式反应ＳＤＳ：十二烷基磺酸钠犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶４　检疫方法４．１　病毒的分离与鉴定４．１．１　器材４８孔或９６孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、０．２μｍ的微孔滤膜、普通光学显微镜。１犛犖／犜２７０８—２０１０４．１．２　试剂ＭＥＭ培养液、胎牛血清、Ｄ氨基葡萄糖、青霉素（１０４ＩＵ／ｍＬ）和链霉素（１０４μｇ／ｍＬ）溶液。４．１．３　犘犆犞２易感细胞ＰＫ１５细胞。４．１．４　犘犅犛见附录Ａ。４．１．５　病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品或病猪的抗凝血，４℃保存，立即送检。若不能立即送检，应置－２０℃以下条件保存备检。４．１．６　病毒分离将采集的组织样品用ＰＢＳ按１∶１０的比例进行稀释，研磨成匀浆，或取病猪的抗凝血，反复冻融３次后，４５００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液，经微孔滤膜过滤除菌，接种在无ＰＣＶ感染的正常ＰＫ１５细胞单层上，感作１ｈ，倾尽接种液，加入含２％胎牛血清的ＭＥＭ培养液（含１００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１００μｇ／ｍＬ的链霉素），３７℃继续培养２４ｈ，弃上清液，加入３００ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｄ氨基葡萄糖０．５ｍＬ，作用３０ｍｉｎ，倾去，ＰＢＳ洗涤，再加入含２％胎牛血清的ＭＥＭ培养液（含１００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１００μｇ／ｍＬ的链霉素），继续培养２４ｈ～４８ｈ。４．１．７　病毒鉴定ＰＣＶ２感染ＰＫ１５细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用ＩＦＡ（见４．２）或ｎＰＣＲ（见４．３）等方法做进一步的鉴定。４．２　间接免疫荧光试验（犐犉犃）４．２．１　器材ＩＦＡ诊断板、荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。４．２．２　试剂ＰＣＶ２单克隆抗体、ＦＩＴＣ结合物、０．２５％胰蛋白酶、丙酮。４．２．３　操作方法４．２．３．１　吸取５０μＬ接种过待检样品、经０．２５％胰蛋白酶消化的ＰＫ１５细胞，加入ＩＦＡ诊断板中，置超净工作台中风干，然后加１００μＬ丙酮（－２０℃预冷）固定１０ｍｉｎ，同时设正常ＰＫ１５细胞孔和感染了ＰＣＶ２的ＰＫ１５细胞孔作为阴、阳性对照。４．２．３．２　用ＰＢＳ（１００μＬ／孔）清洗ＩＦＡ诊断板３次，每次３ｍｉｎ，最后弃去ＰＢＳ，在吸水纸上轻轻拍干。滴加工作浓度（ＰＢＳ稀释１０００倍）的鼠源ＰＣＶ２单克隆抗体１００μＬ，置于湿盒内，３７℃感作１ｈ。４．２．３．３　ＰＢＳ清洗ＩＦＡ诊断板３次，方法同４．２．３．２。４．２．３．４　加入工作浓度（ＰＢＳ稀释５０倍）的兔抗鼠ＦＩＴＣ结合物，１００μＬ／孔，置于湿盒内，３７℃感作３０ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。２犛犖／犜２７０８—２０１０４．２．３．５　弃去板中液体，ＰＢＳ清洗４次，方法同４．２．３．２。４．２．４　荧光显微镜检查在放大１００×～４００×条件下镜检，荧光显微镜采用蓝紫光（波长：４０５ｎｍ～４９０ｎｍ）。４．２．５　结果判定与解释标准阳性细胞孔：细胞边界清晰，胞浆内应出现典型的特异性亮绿色荧光。标准阴性细胞孔：细胞边界清晰，细胞胞浆内不应出现特异性亮绿色荧光。在阴阳性对照孔检测结果成立的条件下，待检样品细胞孔的细胞胞浆内如出现特异性亮绿色荧光，则证明待检样品内含有ＰＣＶ２，判为阳性；否则，判为阴性。４．３　巢式聚合酶链式反应（狀犘犆犚）４．３．１　器材微量振荡器、ＰＣＲ仪、微量加样器（０．５μＬ～１０μＬ；５μＬ～２０μＬ；２０μＬ～２００μＬ；１００μＬ～１０００μＬ）及配套的带滤芯吸头、生物安全柜、高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００犵以上）、凝胶成像系统、电泳仪、ＰＣＲ管、１．５ｍＬ的离心管等。４．３．２　试剂４．３．２．１　５０×ＴＡＥ缓冲液（ｐＨ８．５）（见附录Ｂ）。４．３．２．２　ＤＮＡ染料：１０ｍｇ／ｍＬ的溴化乙锭（ＥＢ）或ＥＢ替代物（ＧｏｌｄＶｉｅｗ）。４．３．２．３　６×上样缓冲液（ＬｏｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）。４．３．２．４　苯酚、三氯甲烷、无水乙醇、异戊醇、乙酸钠，均为分析纯，－２０℃保存备用。４．３．２．５　酶与缓冲液：犜犪狇酶（５Ｕ／μＬ）、１０×ＰＣＲ缓冲液。４．３．２．６　氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）。４．３．２．７　ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．３．２．８　琼脂糖。４．３．２．９　蛋白酶Ｋ。４．３．２．１０　十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）。４．３．３　扩增引物Ｐ１：５’ＣＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＧ３’Ｐ２：５’ＡＧＧＡＧＧＣＧＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＧ３’Ｐ３：５’ＴＡＧＧＴＴＡＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴ３’Ｐ４：５’ＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＴＡＴＡＣＴＧ３’外部引物对（Ｐ１、Ｐ２）可以扩增ＰＣＶ１的核苷酸序列，也可以扩增ＰＣＶ２的核苷酸序列，扩增产物约为８８０ｂｐ；内部引物对（Ｐ３、Ｐ４）只可以扩增ＰＣＶ２的核苷酸序列，扩增产物约为２６０ｂｐ。４．３．４　样品制备４．３．４．１　脏器组织采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品，用ＰＢＳ按１∶１０的比例稀释，研磨成匀浆，反复冻融３次后，４５００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液置于１．５ｍＬ的离心管内编号备检。３犛犖／犜２７０８—２０１０４．３．４．２　细胞悬液将接种过疑似含ＰＣＶ２样品的细胞培养液反复冻融３次后，４５００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液置于１．５ｍＬ的离心管内编号备检。４．３．４．３　抗凝血将采集的病猪抗凝血直接编号后备检或４℃保存备检。４．３．５　对照取ＰＣＶ２细胞增殖液或ＰＣＶ２自然感染恢复后的猪抗凝血作为阳性对照；取无ＰＣＶ２感染的细胞悬液或无ＰＣＶ２感染且未经免疫的猪抗凝血作为阴性对照；取无菌去离子水作为空白对照。４．３．６　操作步骤４．３．６．１　犇犖犃模板的制备取病猪抗凝血或经匀浆后提取的组织上清液或细胞悬液１００μＬ，加入４００μＬ的ＰＢＳ，然后加入蛋白酶Ｋ至终浓度１００μｇ／ｍＬ和ＳＤＳ至终浓度１０ｇ／Ｌ，５５℃水浴２ｈ，用等体积的苯酚、苯酚三氯甲烷异戊醇混合液（体积比为２５∶２４∶１）、三氯甲烷各抽提１次，吸取水相，加入１／１０体积３ｍｏｌ／Ｌ的乙酸钠和２．５倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，－２０℃沉淀１ｈ，４℃条件下（１２０００犵）离心１５ｍｉｎ，弃上清液，沉淀干燥后悬浮于无菌去离子水中，取适量用作ＰＣＲ模板或－２０℃以下保存备用。４．３．６．２　反应体系（两次的反应体系均为５０μ犔）引物（浓度为１０ｐｍｏｌ／Ｌ）：上下游引物各１μＬ。１０×ＰＣＲ缓冲液：５μＬ。１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ：１μＬ。犜犪狇酶：１μＬ。模板ＤＮＡ：２μＬ。加入３９μＬ的无菌去离子水，充分混匀，３０００犵以下瞬时离心，置ＰＣＲ仪内开始反应。４．３．６．３　对照组的设置同时设置ＰＣＶ２阴性对照、ＰＣＶ２阳性对照和空白对照。对照组反应体系中，除模板外其余组成成分与４．３．６．２相同。４．３．６．４　反应条件（两次的反应条件相同）预变性：９４℃／２ｍｉｎ。扩增：９４℃／３０ｓ，６５℃／３０ｓ，７２℃／１ｍｉｎ，３０个循环。延伸：７２℃／５ｍｉｎ。反应结束后取出ＰＣＲ反应管，３０００犵以下瞬时离心，取扩增产物进行电泳分析。４．３．６．５　电泳分析取１．５ｇ琼脂糖，加入１００ｍＬ的１×ＴＡＥ缓冲液（见附录Ｂ），配制１．５％的琼脂糖溶液。加热溶解，待冷却（约５５℃）后，在每１００ｍＬ琼脂糖溶液中加入５μＬ的ＥＢ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）或ＥＢ替代物（ＧｏｌｄＶｉｅｗ），混匀，制备电泳凝胶。在凝胶孔内分别添加５μＬ扩增产物（需和上样缓冲液充分混合）和４犛犖／犜２７０８—２０１０ＤＮＡ分子量标记物（Ｍａｒｋｅｒ），电泳（电压约为５Ｖ／ｃｍ）后取琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内进行分析。４．３．６．６　序列测定对扩增产物（最好预先进行适当的浓缩）进行序列测定，然后运用适当的软件对测序结果进行同源性分析。４．３．６．７　结果判定在各对照组成立的条件下，以标准Ｍａｒｋｅｒ及阳性对照为基准，ｎＰＣＲ结束后若得到２６０ｂｐ左右的电泳条带，则可初步判断为ＰＣＶ２阳性，否则判为ＰＣＶ２阴性。若ｎＰＣＲ扩增产物与Ｇｅｎｂａｎｋ中发布的有关序列或参考序列（参见附录Ｃ）的同源性高于９０％以上，则判为ＰＣＶ２阳性，否则判为ＰＣＶ２阴性。４．４　荧光聚合酶链式反应（狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚）４．４．１　试剂４．４．１．１　犜犪狇酶（５Ｕ／μＬ），－２０℃保存。４．４．１．２　ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．４．１．３　苯酚、三氯甲烷、无水乙醇、乙酸钠，均为分析纯，－２０℃保存备用。４．４．１．４　７５％乙醇，－２０℃保存备用。４．４．１．５　荧光定量ＰＣＲ试剂盒（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｐｒｅｍｉｘ或ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ），购于试剂公司。４．４．２　引物和探针引物Ｐ５：５’ＣＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧ３’引物Ｐ６：５’ＣＴＴＧＡＣＡＧＴＡＴＡＴＣＣＧＡＡＧＧＴ３’探针：ＦＡＭ５’ＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＧ３’ＴＡＭＲＡ４．４．３　器材微量振荡器、ＡＢＩ９７００或Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ荧光ＰＣＲ仪及配套的毛细管、微量加样器（０．５μＬ～１０μＬ、５μＬ～２０μＬ、０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ）及配套的带滤芯吸头、高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００犵以上）、１．５ｍＬ的离心管、生物安全柜、超纯水系统等。４．４．４　样品制备详见４．３．４。４．４．５　犇犖犃模板的制备详见４．３．６．１。４．４．６　荧光犘犆犚反应４．４．６．１　反应体系（２５μ犔）引物（浓度为１０ｐｍｏｌ／Ｌ）：上下游引物各０．５μＬ。ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＰｒｅｍｉｘ或ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ：１２．５μＬ。５犛犖／犜２７０８—２０１０探针：０．５μＬ。模板ＤＮＡ：１μＬ。加入１０μＬ的无菌去离子水，混匀，３０００犵以下瞬时离心后置荧光ＰＣＲ仪内开始反应。４．４．６．２　对照组的设置同时设置ＰＣＶ２阴性对照、ＰＣＶ２阳性对照和空白对照。对照组反应体系中，除模板外其余组成成分与４．４．６．１相同。４．４．６．３　反应条件预变性９４℃／３０ｓ。扩增９４℃／１０ｓ，６０℃／３０ｓ，４０个循环，在退火延伸时收集各循环的荧光。反应结束后，根据荧光曲线和Ｃｔ