SNT 2497.27-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第27部分流式细胞术检测凋亡

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２７—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２７部分：流式细胞术检测凋亡犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２７：犜犺犲狌狊犪犵犲狅犳犳犾狅狑犮狔狋狅犿犲狋狉狔犻狀犪狆狅狆狋狅狊犻狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第２７部分。本部分修改采用《毒理学实验方法与技术》中的流式细胞检测方法，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１做了编辑性修改。本部分的附录Ａ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：冯智劼、王利兵、王华、李学洋、刘伟、丁宇。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２７—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２７部分：流式细胞术检测凋亡１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品流式细胞术检测凋亡的术语和定义、试验方法和结果分析。本部分适用于进出口危险化学品流式细胞术检测凋亡的试验。２　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１凋亡　犪狆狅狆狋狅狊犻狊也称为“程序性细胞死亡”，是一种细胞受环境刺激后，在基因调控之下所产生的自然死亡现象。凋亡最初由特征性的形态变化来确定，包括：ＤＮＡ的程序性降解、染色质浓缩、细胞缩小和碎裂。它可以是生理性的，或由化疗药物及放射诱发。２．２坏死　狀犲犮狉狅狊犻狊活体内局部组织、细胞的死亡称为坏死。坏死组织细胞的代谢停止，功能丧失。坏死的形态变化可以是由损伤细胞内的水解酶的降解作用引起，也可以由游走来的白细胞释放的水解酶的作用引起。２．３流式细胞术　犳犾狅狑犮狔狋狅犿犲狋狉狔是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的物理性质及化学性质，如细胞大小、内部结构、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质、抗原等进行快速测定并可分类收集的一种现代分析技术。３　试验方法３．１　仪器设备———流式细胞仪；———普通低速离心机；———漩涡混匀仪；———微量加样器。３．２　试剂和耗材———ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ试剂盒（含荧光标记的ＡｎｎｅｘｉｎＶ，ＰＩ和ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）；———２００目过滤尼龙网；———０．２２μｍ的滤膜；———ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ＝７．４）和蒸馏水（用滤器滤过）；———流式细胞仪的保养试剂；———加样枪头。试剂如自行配置，ＰＢＳ和ＢｉｎｇｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ和ＰＩ的配置可以参见附录Ａ。１犛犖／犜２４９７．２７—２０１０３．３　试验步骤３．３．１　细胞悬液的制备试验所用细胞可来源于各种组织也可为直接培养的细胞。若细胞来源于组织，需将其充分分离，并用２００目尼龙网过滤，收集细胞悬液。将细胞用ＰＢＳ缓冲液洗涤两次［（５００～８００）ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ／次］，调整细胞浓度为１×１０６个／ｍＬ。３．３．２　分组根据试验目的进行分组。要包含对照组，包括未标记的细胞、仅用ＡｎｎｅｘｉｎＶ标记的细胞，仅用ＰＩ染色的细胞。３．３．３　染色（如果使用试剂盒，加入试剂的剂量可以按说明书进行）ａ）　取１００μＬ（１×１０５个细胞）到５ｍＬ流式加样管中；ｂ）　加入荧光标记的ＡｎｎｅｘｉｎＶ试剂５μＬ至上述管中；ｃ）　加入ＰＩ染料１０μＬ入加样管中［ＰＩ的加入量可以根据不同的目的细胞和试验方案进行调整，加入量可在（２～１０）μＬ／管进行调整］；ｄ）　轻轻摇动细胞，避光，室温保存１５ｍｉｎ。３．３．４　上机检测ａ）　在管中加入４００μＬ的１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（也可按照试剂盒的说明进行使用）；ｂ）　在１ｈ上流式细胞仪进行分析（选择相应的模块）。４　试验结果４．１　不同阶段细胞的表型由于细胞花丝期间也可以出现ＰＳ（膜磷脂酰丝氨酸）的外露，ＡｎｎｅｘｉｎＶ应与检测细胞活性的染料ＰＩ联合后用来区分不同细胞，结果见表１。表１　不同阶段细胞的表型细胞类型ＡｎｎｅｘｉｎＶＰＩ凋亡细胞（早期）机械性损伤细胞继发性坏死细胞正常细胞＋－＋－－＋＋－４．２　数据处理选用适当的统计学方法对试验结果进行分析，判断受试物是否能引起凋亡，及在不同浓度下的凋亡的差别是否有统计学意义。２犛犖／犜２４９７．２７—２０１０附　录　犃（资料性附录）试剂的配置犃．１　犘犅犛的配置ＮａＣｌ　　　　　　　　　　１３７ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ２．７ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ４．３ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４１．４ｍｍｏｌ／Ｌ用ＨＣｌ或ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．２犃．２　犅犻狀犱犻狀犵犅狌犳犳犲狉ＨｅｐｅｓＮａＯＨｐＨ＝７．４　　　　　１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ１４０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２２．５ｍｍｏｌ／Ｌ保存于２℃～８℃犃．３　犘犐用１×ＰＢＳ配成５０μｇ／ｍＬ的贮液，保存于２℃～８℃。犛犖／犜２４９７．２７—２０１０书书书０１０２—７２７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第２７部分：流式细胞术检测凋亡ＳＮ／Ｔ２４９７．２７—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数７千字２０１０年５月第一版　２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９３３　定价１４．００元