SNT 2497.18-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第18部分DNA加合物的检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１８—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１８部分：犇犖犃加合物的检测方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１８：犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳犇犖犃犪犱犱狌犮狋２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１８部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局，中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、赵好力宝、赵黎华、韩伟、熊中强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１８—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１８部分：犇犖犃加合物的检测方法１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品ＤＮＡ加合物检测方法的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和试验结果。本部分适用于３２Ｐ后标记法检测进出口危险化学品引起的ＤＮＡ加合物。２　术语、定义和缩略语２．１　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１．１犇犖犃加合物　犇犖犃犪犱犱狌犮狋ＤＮＡ加合物就是亲电性的化合物或其代谢产物与ＤＮＡ形成共价相联的化合物，是ＤＮＡ化学损伤的主要形式之一。２．２　缩略语下列缩略语适用于本部分。２．２．１犇犖犃　脱氧核糖核酸３　原理含有加合物的ＤＮＡ链在核酸内、外切酶的作用下降解为３′单磷酸核苷，用核酸酶（Ｐ１或Ｓ１）处理３′单磷酸核苷，正常的３′单磷酸核苷被去磷酸化，而具有加合物的３′单磷酸核苷可以抵抗这一作用。在特异的Ｔ４多核苷酸激酶的作用下，３２ＰＡＴＰ的磷酸根基团转移到具有加合物的核苷酸的５′羟基末端，形成３′５′二磷酸核苷，通过检测３２ＰＡＴＰ的量对ＤＮＡ损伤产生的加合物进行定量。４　主要试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。４．１　内切酶。４．２　外切酶。４．３　Ｐ１核酸酶。４．４　３２ＰＡＴＰ。４．５　Ｔ４多核苷酸激酶。４．６　Ｔ４多核苷酸激酶缓冲液：０．１ｍｏｌ／ＬＢｉｃｉｎｅＮａＯＨ，０．１ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１ｍｏｌ／Ｌ二硫化苏糖醇，１０ｍｍｏｌ／Ｌ精脒，ｐＨ值９．５。４．７　ＯＤＳＴＬＣ板（反相吸附薄层色谱板）。４．８　ＰＥＩＴＬＣ板（阴离子交换薄层色谱板）。５　主要仪器设备５．１　紫外分光光度计。１犛犖／犜２４９７．１８—２０１０５．２　液闪计数仪。６　试验步骤６．１　犇犖犃的消化取（６～１０）μｇＤＮＡ溶解液，加入适当内切酶、外切酶和缓冲液，置于３７℃水浴（２～４）ｈ，然后加入适量Ｐ１核酸酶，继续孵育４０ｍｉｎ。６．２　同位素标记在Ｔ４多核苷酸激酶催化下加约１００μＣｉ左右的３２ＰＡＴＰ，在Ｔ４多核苷酸激酶缓冲液存在下３７℃反应３０ｍｉｎ，然后加入１μＬ腺苷三磷酸双酶继续孵育３０ｍｉｎ，以水解多余的３２ＰＡＴＰ。６．３　加合物的分离利用ＤＮＡ加合物和ＤＮＡ水解物色谱性能的差异，将样品点在ＯＤＳＴＬＣ板上，分离加合物和正常核酸，还可选用ＰＥＩＴＬＣ板分离不同的加合物。６．４　犇犖犃加合物的定量根据放射自显影ＤＮＡ加合物的位置，将ＰＥＩ纤维薄膜上有放射活性斑块的纤维素用小刀刮下，并放有５ｍＬ闪烁液的闪烁瓶中，在液闪计数仪上测定放射性。７　试验结果ＤＮＡ加合物相对标记值ＲＡＬ按式（１）计算：ＲＡＬ＝ｃ．ｐ．ｍＳ．Ｐ．ａｃｔ（狀×３２４０）…………………………（１）　　式中：ｃ．ｐ．ｍ———加合物斑点数；Ｓ．Ｐ．ａｃｔ———３２ＰＡＴＰ的比活度（ｃ．ｐ．ｍ／ｐｍｏｌ）；狀———试验用ＤＮＡ样品量；３２４０———１μｇＤＮＡ＝３２４０ｐｍｏｌ。２犛犖／犜２４９７．１８—２０１０书书书０１０２—８１７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第１８部分：犇犖犃加合物的检测方法ＳＮ／Ｔ２４９７．１８—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数６千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９５１　定价１４．００元