项目九：食品常见有害有毒物质测定

项目九食品常见有害有毒物质的检测内容简介本章讲述了食品食品中常见有害有毒物质如有机氯农药、有机磷农药、黄曲霉毒素等的测定方法以及各种测定方法的注意事项。项目九食品常见有害有毒物质的检测学习目的与要求：1、掌握食品常见有害有毒物质如有机氯农药、有机磷农药残留及黄曲霉毒素等的测定操作方法2、熟练使用气相色谱和液相色谱仪项目九食品常见有害有毒物质的检测重点：有机氯农药、有机磷苯农药残留及黄曲霉毒素等的测定操作方法、气相色谱和液相色谱仪的使用难点：气相色谱和液相色谱仪的使用第七章食品常见有害有毒物质的检测第一节有机氯农药残留的测定第二节有机磷农药残留的测定第三节黄曲霉毒素的测定本章目录第七章食品常见有害有毒物质的检测一、定性检验1、焰色法（1）原理此法是利用样品中的有机氯受热分解为氯化氢，它与铜勺表面的氧化铜作用，生成挥发性的氯化铜，在无色火焰中呈绿色。用以鉴别样品提取液中有机氯农药的存在。第一节有机氯农药残留的测定第一节有机氯农药残留的测定（2）操作步骤取铜小勺在煤气灯或酒精灯上灼烧，直至铜勺表面覆盖一层黑色氧化铜为止。取少量怀疑污染有机氯农药的食品，用乙醚浸渍振摇并过滤。将滤液逐滴加在铜勺表面蒸发，然后进行灼烧，呈绿色火焰者，说明食品被有机氯农药(包括DDT及六六六)污染。若样品中农药含量很低，可将乙醚提取液浓缩蒸干，用少量乙醇溶解残留物，然后按上法检验，本法最低检出范围为1ug有机氯。第一节有机氯农药残留的测定2、亚铁氨化银试纸法（1）原理此法是根据有机氯农药与碳酸钠灼烧生成氯化钠。与硫酸作用生成氯化氢。氯化氢与亚铁氰化银试纸反应，在硫酸铁存在下产生蓝色，可鉴别有机氯的存在。第一节有机氯农药残留的测定（2）操作步骤a、亚铁氰化银试纸称取硝酸银2．5g、亚铁氰化钾1．3g，分别溶于25mL水中。将硝酸银溶液缓慢加到亚铁氰化钾溶液中，离心分离，将沉淀物反复用水洗涤至不含银离子为止。在沉淀中加浓氨水25mL，摇匀后，将滤纸浸入悬浮氨溶液中5min，取出试纸用热风吹干，备用.第一节有机氯农药残留的测定b、检测取10．Og左右待测磨碎样品，置于三角烧瓶中，加入20mL乙醚，振摇后，分出乙醚层。置水浴上挥发至0．4ml，移入小试管中，加入一勺碳酸钠，在水浴上蒸干、冷却。取亚铁氰化银试纸条，在1g／L硫酸铁溶液中浸湿后，悬挂于橡皮塞下。向试管内残渣小心滴人浓硫酸2～3滴，迅速将挂有试纸的橡皮塞塞紧小试管，将试管移人水浴内加热smin，如果试纸变为蓝色，表示样品中有有机氯农药存在。试验中应防止无机氯的干扰。二、定量检验采用气相色谱法1、农药提取2、净化3、测定（1）气相色谱参考条件色谱柱：内径3～4mm，长1.2～2m的玻璃柱，内装涂以OV-7（15g/L）和QF-1（20g/L）的混合固定液的80～100目硅藻土。第一节有机氯农药残留的测定（2）电子捕获检测器汽化室温度：215℃；色谱柱温度：195℃；检测器温度：225℃；载气（氮气）流速：90ml/min；（3）色谱图（4）计算第一节有机氯农药残留的测定1000100012111VVmAX一、定性检验1、刚果红法（1）原理利用样液中的有机磷农药经溴氧化后，与刚果红作用，生成蓝色化合物，来鉴别样品是否存在有有机磷农药。第二节有机磷农药残留的测定第二节有机磷农药残留的测定2、操作步骤取经粉碎的样品用苯浸泡、振摇，用滤纸过滤，取滤液于蒸发皿上，加入100g／L甘油甲醇溶液1滴，沥干，加1mL水混匀。将样液滴于定性滤纸上，挥发干。将滤纸置于溴蒸气上熏5min，取出，在通气处将溴挥发尽。滴人5g／L刚果红乙醇溶液，置于滤纸的点样处，如果滤纸显示出蓝紫色则表示样品中有有机磷存在。呈粉红色者则为溴的色泽。第二节有机磷农药残留的测定2、纸上斑点法（1）原理样液中的硫代磷酸酯类有机磷与2，6一二溴苯醌氯酰亚胺，在溴蒸气作用下，形成各种有颜色的化合物，用以鉴定是否存在有机磷及是哪一种有机磷。第二节有机磷农药残留的测定（2）操作步骤a、2，6一二溴苯醌氯酰亚胺试纸称取0．05g2，6一二溴苯醌氯酰亚胺，溶于10mL95%(体积分数)乙醇中，将定性滤纸浸湿，晾干备用。b、检验吸取按刚果红法制备的样液1滴，于2，6一二溴苯醌氯酰亚胺试纸上，稍干，置于溴蒸气上蒸熏片刻，呈现出不同颜色的斑点，根据所显示斑点的颜色鉴别属于哪种有机磷农药。试验时，为防止色素干扰，试纸要临时配制。有机磷农药呈色反应如表6-1所示。农药种类反应颜色反应时间3911鲜黄，周围较深5s-3min1605淡黄→紫红30s-3min1059鲜黄→暗黄30s-3min4049黄→黄棕30s-5min乐果黄→橙黄表6一l有机磷农药的呈色反应20s-5minM-74淡土黄→暗紫红30s-5min三硫磷土黄→杏红15s-5min1240鲜黄→暗黄30s-3min有机磷农药的呈色反应二、定量检测采用气相色谱检测法1、标准溶液的配制2、试样制备3、有机磷农药提取4、有机磷农药净化5、测定第二节有机磷农药残留的测定5、测定（1）气相色谱条件；色谱柱：①玻璃柱2.6m×3mm（i·d），填装涂有4.5％DC200＋2.5％OV－17的ChromosorbWAWDMCS（80～100目）的担体。②玻璃柱2.6m×3mm（i·d），填装涂有1.5％（质量分数）DCOE－1的ChromosorbWAWDMCS（60～80目）气体速度：氮气（N2）50mL／min、氢气（H2）100ml/min、空气50mL／min。温度：柱温240℃、汽化室260℃、检测器270℃．第二节有机磷农药残留的测定（2）测定。吸取2～5μL混合标准液及样品净化液，注入色谱仪中，以保留时间定性。以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。6、结果计算第二节有机磷农药残留的测定100010004231mVVAEVVAXsisiii7、16种有机磷农药的色谱图第二节有机磷农药残留的测定黄曲霉毒素，是一组化学结构类似的化合物。已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。第三节黄曲霉毒素的测定黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B2黄曲霉毒素B3黄曲霉毒素B4黄曲霉毒素B5黄曲霉毒素B6表1中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量第三节黄曲霉毒素的测定食物名称最高允许含量/(ug/kg)玉米、花生、花生油、坚果和干果(核桃、杏仁)20(黄曲霉毒素B1)玉米、花生仁制品(按原料折算)20(黄曲霉毒素B1)大米、其他食用油(香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油)10(黄曲霉毒素B1)其他粮食(麦类、面粉、薯干)、发酵食品(酱油、食用醋、豆豉、腐乳制品)、淀粉类制品(糕点、饼干、面包、裱花蛋糕)5黄曲霉毒素B1)牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油)、黄油、新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉)0.5(黄曲霉毒素M1)一、薄层层析法1、仪器小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器、展开槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光灯100—125W、波长365nm滤光片、微量注射器。2、测定方法(一)样品处理(二)黄曲霉毒素提取第三节黄曲霉毒素的测定(三)测定1．单向展开法(1)薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒入涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可再活化后使。第三节黄曲霉毒素的测定(2)点样在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血红素吸管滴加样液。第一点：10μlAFTB,标准使用液(0.04μg／ml)。第二点：20μl样液。第三节：20μl样液+10μL0.04μg／mlAFTB1标准使用液。第四点：20μl样液+10μL0.02μg／mlAFTB1标准使用液。第三节黄曲霉毒素的测定(3)展开与观察在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮—三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察结果.方法如下：a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1，荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0.0004μg，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标准为0.002μg，主要起定位作用。第三节黄曲霉毒素的测定b．若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTB1含量＜5μg／kg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则需进行确证试验。(4)确证试验：为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：10μL0.04μg／mLAFTB1标准使用液。第二点：20μL样液第三节黄曲霉毒素的测定于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。第三点：10μL0.04μg／mLAFTB1标准使用液。第四点：20μL样液。按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照。第三节黄曲霉毒素的测定（5）稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1标准点最低检出量（0.0004μg）的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为即为5μg／kg。若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：第一点：10μLAFTB1标准使用液（0.04μg／mL）。第二点；根据情况滴加10μL样液。第三点：根据情况滴加15μL样液。第四点：根据情况滴加20μL样液。第三节黄曲霉毒素的测定（6）结果计算第三节黄曲霉毒素的测定12110000004.0mVDVX式中X——样品中AFTB1的含量，μy/kg；V1——加入苯一乙睛混合液的体积，mL；V2——出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D——样液的总稀释倍数；m1——加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004——AFTB1的最低检出限量，μg。2．双向展开法(1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上，在距左边缘0.8～lcm处，各滴加10μLAFTB1(0.04μg／mL)标准液，在距左边缘2.8～3cm处，各滴加20μL样液。然后在第二块板的样液点上加滴10μLAFTB1(0.04μg／mL)标准液，在第三块板的样液点上加滴10μLAFTB1(0.02μg／mL)标准液。第三节黄曲霉毒素的测定(2)展开a．横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于展开槽内展酗，展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复1～2次。b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮—三氯甲烷(8:92)展开至10～l2cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。第三节黄曲霉毒素的测定(3)观察与评定结果:a．在紫外光下观察第一、二块板，若第二块板在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTB1含量＜5μg／kg。b．若第一块板与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，着第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性,则第二块板可省略，直接做第三块。第三节黄曲霉毒素的测定(4)确认试验：另取薄层板二