SNT 2060-2008 进出口蜂王浆中泰乐菌素残留量测定方法 酶联免疫法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０６０—２００８进出口蜂王浆中泰乐菌素残留量测定方法　酶联免疫法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狔犾狅狊犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口蜂王浆中泰乐菌素残留量测定方法　酶联免疫法ＳＮ／Ｔ２０６０—２００８中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张１　字数２３千字２００８年７月第一版　２００８年７月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１８９２４　定价１０．００元书书书前　　言　　本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：施伟良、张晓峰、黎昊雁、朱振江、何永强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０６０—２００８进出口蜂王浆中泰乐菌素残留量测定方法　酶联免疫法１　范围本标准规定了蜂王浆和王浆冻干粉中泰乐菌素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于蜂王浆和王浆冻干粉中泰乐菌素残留量的测定。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—１９９２，ｎｅｑＩＳＯ３６９６：１９８７）３　方法提要本标准以酸性的庚烷磺酸钠缓冲液来提取蜂王浆中残留的泰乐菌素，沉淀王浆中蛋白后并调节ｐＨ至７．０。处理后样品中残留的泰乐菌素与酶标记泰乐菌素共同竞争结合至包被在微孔板上的绵羊抗兔抗体，通过洗涤除去未结合的泰乐菌素和酶标记泰乐菌素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中泰乐菌素的含量。４　试剂和材料除注明外，所有试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１　泰乐菌素检测试剂盒（参见附录Ａ）。４．２　庚烷磺酸钠缓冲液：称取１０．１ｇ庚烷磺酸钠［ＣＨ３（ＣＨ２）６ＳＯ３Ｎａ］，１１．４ｇ磷酸钠（Ｎａ３ＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）用水溶解并定容到１Ｌ，用磷酸调节ｐＨ至２．０。４．３　磷酸盐缓冲液：称取磷酸钠（Ｎａ２ＨＰＯ３·１２Ｈ２Ｏ）３４ｇ，用水溶解并定容到１Ｌ，调节ｐＨ至８．０。４．４　ＨＬＢ小柱，Ｏａｓｉｓ（或相当产品），３ｍＬ（６０ｍｇ）。４．５　泰乐菌素标准品：纯度大于等于９８％。４．６　泰乐菌素标准品溶液的配制：用甲醇作为溶剂配制成４００μｇ／ｍＬ的储存液，于－２０℃条件下保存。５　仪器和设备５．１　酶标仪。５．２　八道移液器：１０μＬ～１００μＬ。５．３　单道移液器：１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ和２ｍＬ～１０ｍＬ。５．４　混合振荡器。５．５　高速低温离心机：６０００ｒ／ｍｉｎ。５．６　具塞试管：５０ｍＬ。５．７　电子天平：０．０１ｇ～１００ｇ。５．８　酸度计。１犛犖／犜２０６０—２００８６　试样的制备与保存６．１　试样的制备原始样品总量不得少于２００ｇ，蜂王浆充分搅拌均匀后，将样品分成两等份；冻干粉采用四分法，将样品分成两等份。分好的样品装入洁净容器，加封并做标识。６．２　试样的保存将样品于－２０℃～－１８℃条件下保存。７　分析步骤７．１　提取称取２．０ｇ蜂王浆样品，置于５０ｍＬ具塞试管中，加入６ｍＬ庚烷磺酸钠缓冲液（４．２），充分振荡，１５℃条件下６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取０．５ｍＬ上清液于一干净试管，加入０．５ｍＬ磷酸盐缓冲液（４．３），混合均匀，调节ｐＨ至６．８～７．２，此溶液即可供ＥＬＩＳＡ检测用。最后样品稀释倍数为８。王浆冻干粉则用水以１∶２比例稀释，充分浸泡（２ｈ以上）后，称取２．０ｇ按照上述王浆前处理方法进行提取，最后稀释倍数为２４。７．２　测定条件１）１）　给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。７．２．１　操作条件所有操作应在室温下（２０℃～２４℃）进行，泰乐菌素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（２０℃～２４℃）后方可使用。７．２．２　洗板条件人工洗涤次数５次以上，每次加入洗涤液量为２５０μＬ；自动洗板可以预定５次。７．２．３　酶标仪测定条件酶标仪测定波长为４５０ｎｍ。７．３　测定步骤７．３．１　将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。７．３．２　吸取５０μＬ泰乐菌素标准溶液（浓度分别为：０、０．３、０．６、１．２５、２．５、５、１０、２５ｎｇ／ｍＬ）于孔Ａ１、Ａ２—Ｈ１、Ｈ２；吸取５０μＬ样品溶液于其余微孔中。７．３．３　吸取１００μＬ泰乐菌素酶标记物溶液于每一个微孔。用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀，室温（２０℃～２４℃）下避光温育１０ｍｉｎ（温育过程中晃动／振动反应板）。７．３．４　倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，用洗涤缓冲液洗板６次。７．３．５　迅速加入１００μＬ底物溶液于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，室温（２０℃～２４℃）下避光温育１０ｍｉｎ。７．３．６　迅速加入１００μＬ反应终止液于每一个微孔，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在４５０ｎｍ处测量吸光度（加入反应终止液后应在３０ｍｉｎ内读取吸光度）。７．４　平行试验按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。７．５　空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。２犛犖／犜２０６０—２００８７．６　阳性质控每次测定均应做一个添加自配泰乐菌素标准品溶液（４．６）的监控样品。以确定实验过程的操作准确性。８　结果计算标准品和样品的ＯＤ平均值除以零标准（Ａ１、Ａ２）的平均ＯＤ值，再乘以１００，计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为１００％（最大吸光度值），其他ＯＤ值为最大吸光度值的百分数。以吸光度的百分比值（犅／犅０）为纵坐标（％），泰乐菌素标准溶液浓度（ｎｇ／ｍＬ）的对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的泰乐菌素浓度后，结果按式（１）进行计算：犡＝犮×犞×１０００犿×１０００……………………………（１）　　式中：犡———样品中泰乐菌素的残留量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮———从标准工作曲线上得到的样品中泰乐菌素浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（ｇ）。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。所得结果表示至一位小数。９　确证试验如被测样品中泰乐菌素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。１０　本方法测定低限和回收率１０．１　检测低限本方法的检测低限为１０μｇ／ｋｇ。１０．２　回收率本方法泰乐菌素添加浓度和回收率实验数据：———添加量为１０μｇ／ｋｇ时，回收率为７３％～９７％；———添加量为１００μｇ／ｋｇ时，回收率为８２．７％～１１３．７％；———添加量为５００μｇ／ｋｇ时，回收率为８７．４％～１１２．８％。３犛犖／犜２０６０—２００８附　录　犃（资料性附录）泰乐菌素试剂盒（杭州迪恩科技有限公司产品）２）犃．１　试剂盒组成犃．１．１　预包被抗体的９６孔板：１２条×８孔。犃．１．２　泰乐菌素标准溶液：１００ｎｇ／ｍＬ。犃．１．３　泰乐菌素酶标记物溶解液。犃．１．４　泰乐菌素酶标记物冻干粉：根据泰乐菌素试剂盒中说明，可用酶标记物溶解液配制成泰乐菌素酶标记物溶液。犃．１．５　显色剂。犃．１．６　稀释液：根据泰乐菌素试剂盒中说明，可用蒸馏水１０倍稀释后使用。犃．１．７　洗涤浓缩液（１０倍浓缩）：可用水稀释后使用。犃．１．８　反应终止液。试剂盒应在４℃～８℃避光条件下保存。犃．２　标准校正曲线标准校正曲线见图Ａ．１。狔＝－０．１３８７ｌｎ狓＋０．５２８３犚２＝０．９９３８图犃．１　标准校正曲线２）　给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。４犛犖／犜２０６０—２００８犉狅狉犲狑狅狉犱犜犺犲犪狀狀犲狓犃狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狀犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲犱狅犳犮犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犪犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犪犱犿犻狀犻狊狋犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犣犺犲犼犻犪狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌．犜犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犿犪犻狀犾狔犱狉犪犳狋犲犱犫狔犠犲犻犾犻犪狀犵犛犺犻，犉犲狀犵狓犻犪狅犣犺犪狀犵，犎犪狅狔犪狀犔犻，犣犺犲狀犼犻犪狀犵犣犺狌，犢狅狀犵狇犻犪狀犵犎犲．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犲狀狋狉狔犲狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲．５犛犖／犜２０６０—２００８犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狔犾狅狊犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔１　犛犮狅狆犲犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲犿犲狋犺狅犱狊狅犳犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犫狔犈犔犐犛犃犿犲狋犺狅犱狅犳狋狔犾狅狊犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犪狀犱狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔狆狅狑犱犲狉．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅狋犺犲狊犮狉犲犲狀犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狔犾狅狊犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犪狀犱狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔狆狅狑犱犲狉．２　犖狅狉犿犪狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊犜犺犲犳狅犾犾狅狑犻狀犵狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犮狅狀狋犪犻狀狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狑犺犻犮犺，狋犺狉狅狌犵犺狉犲犳犲狉犲狀犮犲犻狀狋犺犻狊狋犲狓狋，犮狅狀狊狋犻狋狌狋犲狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱．犉狅狉犱犪狋犲犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊，狊狌犫狊犲狇狌犲狀狋犪犿犲狀犱犿犲狀狋狊狋狅，狅狉狉犲狏犻狊犻狅狀狊狅犳，犪狀狔狅犳狋犺犲狊犲狆狌犫犾犻犮犪狋犻狅狀狊犱狅狀狅狋犪狆狆犾狔．犎狅狑犲狏犲狉狆犪狉狋犻犲狊狋狅犪犵狉犲犲犿犲狀狋狊犫犪狊犲犱狅狀狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犲狀犮狅狌狉犪犵犲犱狋狅犻狀狏犲狊狋犻犵犪狋犲狋犺犲狆狅狊狊犻犫犻犾犻狋狔狅犳犪狆狆犾狔犻狀犵狋犺犲犿狅狊狋狉犲犮犲狀狋犲犱犻狋犻狅狀狊狅犳狋犺犲狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犻狀犱犻犮犪狋犲犱犫犲犾狅狑．犉狅狉狌狀犱犪狋犲犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊，狋犺犲犾犪狋犲狊狋犲犱犻狋犻狅狀狅犳狋犺犲狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狉犲犳犲狉狉犲犱狋狅犪狆狆犾犻犲狊．犌犅／犜６６８２犠犪狋犲狉犳狅狉犪狀犪犾狔狋犻犮犪犾犾犪犫狅狉犪狋狅狉狔狌狊犲—犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狋犲狊狋犿犲狋犺狅犱狊（犌犅／犜６６８２—１９９２，狀犲狇犐犛犗３６９６：１９８７）３　犘狉犻狀犮犻狆犾犲犜犺犲犪狊狊犪狔犻狊狆犲狉犳狅狉犿犲犱犻狀犪狆狅犾狔狊狋狔狉犲狀犲犿犻犮狉狅狆犾犪狋犲，犮狅犪狋