SNT 1161-2010 鹿流行性出血病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!!!#$!$代替!!#$$%$&’’&鹿流行性出血病检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’+,*1--)*.2&+3-’’2&4*.5*6+&6+-05++’#$!$7!!7$!发布#$!!7$%7$!实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１６１—２００２《鹿流行性出血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１６１—２００２相比，主要的技术性差异如下：———增加了病原的分离及鉴定；———增加了病毒中和试验；———增加了荧光抗体试验；———增加了反转录聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨晶焰、严树发、陈兵、艾军、华玉卓、叶玲玲、阮周曦、尹尚莲、董俊、周晓黎。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１６１—２００２。Ⅰ犛犖／犜１１６１—２０１０鹿流行性出血病检疫技术规范１　范围本标准规定了鹿流行性出血病的病原分离及鉴定、病毒中和试验、荧光抗体试验、聚合酶链式反应和琼脂凝胶免疫扩散试验检测方法。本标准适用于鹿流行性出血病的诊断和流行病学调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样３　疾病概述鹿流行性出血病（ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｅｅｒ，ＥＨＤ）是由鹿流行性出血病病毒（ＥＨＤＶ）引起的一种病毒性传染病。主要感染白尾鹿、牛、野牛、羊等。动物被感染后可视粘膜和浆膜出血，眼结膜和口腔粘膜暗红或紫蓝，有“蓝舌”样，粪和尿带血，有时唾液也带血，体温呈复相升高，剧烈休克而死亡。该病为非接触性传染病，库蠓可以带毒，并传播本病。其病原、流行病学、临床症状、病理变化、检疫及诊断、防制参见附录Ａ。４　现场检验检疫及采样４．１　现场检验检疫：逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。４．２　采样：按ＧＢ／Ｔ１８０８８的规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。５　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＭＶＲＴ：鸟成骨髓细胞白血病病毒的逆转录酶ＢＨＫ２１　（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ）：幼仓鼠肾细胞ＢＬＰ：乳糖蛋白胨缓冲肉汤ＣＰＥ　（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变ＤＥＰＣ　（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）：焦碳酸二乙酯ＥＨＤＶ　（ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｅｅｒｖｉｒｕｓ）：鹿流行性出血病病毒ＲＴＰＣＲ：反转录聚合酶链式反应ＳＰＦ：无特定病原体动物ＴＣＩＤ５０：组织培养半数感染量Ｔｒｉｚｏｌ：酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液１犛犖／犜１１６１—２０１０６　病毒分离及鉴定６．１　病毒分离６．１．１　试剂与材料６．１．１．１　鹿胎肾细胞或幼仓鼠肾细胞（ＢＨＫ２１）：使用时配制成３×１０５个／ｍＬ细胞悬液。６．１．１．２　ＥＨＤＶ阳性血清和阴性血清：试验前血清需经５６℃灭能３０ｍｉｎ。６．１．１．３　１０日～１１日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．１．４　细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、ＰＢＳ、ＢＬＰ等，配方及配制方法见附录Ｂ。６．１．２　设备６．１．２．１　倒置光学显微镜、荧光显微镜。６．１．２．２　二氧化碳培养箱。６．１．２．３　研钵或组织捣碎机、离心机。６．１．２．４　可调微量移液器。６．１．２．５　细胞培养瓶、细胞培养板等。６．１．２．６　照蛋灯、开孔器。６．１．３　样品采集与处理６．１．３．１　血液样品采集与处理取肝素抗凝血５ｍＬ，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤血样３次～４次，每次２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液后加入等量ＢＬＰ，置冰浴中用超声波（４０μＡ、１ｍｉｎ）处理，经处理的样品当天使用，使用前置４℃保存，剩余样品置－７０℃保存备用。６．１．３．２　组织样品采集与处理无菌采集动物肾、脾、肝各５ｇ，剪碎后加入乳糖蛋白胨缓冲肉汤（ＢＬＰ）１０ｍＬ（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ），置乳钵中研磨，置４℃浸泡４ｈ以上，取上清液５ｍＬ用超声波裂解（１００μＡ、１ｍｉｎ～２ｍｉｎ）处理或冻融三次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液使用，使用前置４℃保存，剩余样品置－７０℃保存备用。６．１．３．３　库蠓样品采集与处理取２００个～３００个库蠓盛于小试管中，加入含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ的ＢＬＰ３ｍＬ～５ｍＬ置冰浴中研磨虫体，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液使用，使用前置４℃保存，剩余样品置－７０℃保存备用。６．１．４　鸡胚静脉接种６．１．４．１　开孔：选择１０ｄ～１１ｄ发育良好的ＳＰＦ鸡胚，在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区，用开孔器开窗备用。６．１．４．２　接种：在无菌条件下，每份样品接种５个鸡胚，每个鸡胚接种０．１ｍＬ，接种后用溶解的石蜡封口，置３３．５℃培养。６．１．４．３　观察：逐日观察并记录，４８ｈ内死亡的鸡胚为非特异性死亡，收取４８ｈ后死亡的鸡胚置４℃２犛犖／犜１１６１—２０１０冰箱保存，于接种后第６ｄ同未死亡鸡胚一起收毒。６．１．４．４　收毒：在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳膜、尿囊膜、羊膜后，取出胚体，置平皿中，在每个胚体上取若干组织块（有病变时，取病变组织），置组织捣碎器或研钵中研磨后，按１∶５加入ＢＬＰ（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ），置４℃浸提４ｈ，冻融三次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液当日使用，剩余样品置－７０℃保存备用。６．１．５　接种敏感细胞盲传６．１．５．１　按常规方法制备鹿胎肾细胞或ＢＨＫ２１细胞单层。６．１．５．２　将收获的鸡胚上清液，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ，离心２０ｍｉｎ。取上清液接种细胞单层，每份病料接种两孔，每孔接种０．１ｍＬ，置３７℃培养，培养５ｄ。６．１．５．３　第５天用吸管吹下被接种的鹿胎肾细胞或ＢＨＫ２１细胞，冻融一次。６．１．５．４　将冻融的细胞悬液接种于已长成单层的鹿胎肾细胞或ＢＨＫ２１细胞单层，３７℃吸附１ｈ后，加入维持液置３７℃培养，２４ｈ后逐日观察细胞病变（ＣＰＥ），连续观察５ｄ。６．１．６　判定病原接种敏感细胞，盲传２代，无细胞病变，判为病毒分离阴性；出现细胞病变，则需进一步进行鉴定。６．２　病毒鉴定６．２．１　荧光抗体试验６．２．１．１　将接种的鹿胎肾细胞或ＢＨＫ２１细胞培养物冻融一次，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液接种于带有玻片的２４孔细胞培养板的细胞单层。每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，３７℃吸附１ｈ后加入维持液，置３７℃培养７２ｈ。６．２．１．２　取出培养板中的玻片，用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ漂洗一次，预冷丙酮固定１５ｍｉｎ。６．２．１．３　每片滴加荧光标记的鹿流行性出血病病毒抗体，使其覆盖于玻片，置暗湿盒中于３７℃作用３０ｍｉｎ。６．２．１．４　用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗片三次，再用蒸馏水洗片一次。６．２．１．５　风干，用碳酸缓冲甘油（配制见附录Ｂ）封片，荧光显微镜检查。６．２．１．６　结果判定：在阳性对照细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光，阴性对照应无荧光或无特异性荧光时，细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性。６．２．２　病毒中和试验６．２．２．１　病毒繁殖收获在鹿胎肾细胞或ＢＨＫ２１细胞上出现ＣＰＥ的病毒悬液，复壮一代，待ＣＰＥ达７５％，收获病毒培养物冻融１次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，分装置－７０℃保存备用。６．２．２．２　毒价测定将鹿流行性出血病病毒接种鹿胎肾细胞或ＢＨＫ２１细胞单层，３７℃吸附１ｈ后加入维持液，置５％二氧化碳培养箱于３７℃培养，接种２４ｈ后逐日观察。待ＣＰＥ达７５％以上，收获病毒培养物，冻融１次或置冰浴中用超声波（４０μＡ／ｍｉｎ）处理，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，分装小瓶，每瓶２ｍＬ，置－７０℃保存备用。将各型病毒在９６孔板上作１００～１０－１０稀释，每个稀释度作８孔，每孔病毒悬液为５０μＬ，加入细胞３犛犖／犜１１６１—２０１０悬液１００μＬ（３×１０５个／ｍＬ），加入细胞维持液５０μＬ，每块板设８孔细胞对照。置５％二氧化碳培养箱于３７℃培养，从２４ｈ～１６８ｈ逐日观察ＣＰＥ。按Ｋａｒｂｅｒ方法计算出各型病毒的细胞半数感染量（ＴＣＩＤ５０／５０μＬ）。６．２．２．３　中和测定６．２．２．３．１　细胞对照：设４孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液１００μＬ（３×１０５个／ｍＬ）、细胞维持液１００μＬ。６．２．２．３．２　阴性对照：设４孔阴性对照，每孔加阴性血清和１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ病毒悬液各５０μＬ，再加入细胞悬液１００μＬ（３×１０５个细胞／ｍＬ）。６．２．２．３．３　病毒回归对照：将被鉴定病毒稀释成１０００、１００、１０、１、０．１ＴＣＩＤ５０／５０μＬ，每个稀释度作４孔，每孔加入病毒悬液５０μＬ，再加入细胞悬液１００μＬ（３×１０５个细胞／ｍＬ），补充细胞维持液５０μＬ。６．２．２．３．４　中和：用１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ鹿流行性出血病病毒分离毒株分别与不同血清型（ＥＨＤＶ１型～ＥＨＤＶ８型）的鹿流行性出血病标准阳性血清（效价不低于１∶３２）作微量中和试验。试验在９６孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经５６℃３０ｍｉｎ灭能。各型阳性血清作１∶１０稀释。每个血清型作４孔，每孔加１∶１０稀释的阳性血清５０μＬ和１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ病毒各５０μＬ、振荡３ｍｉｎ～５ｍｉｎ，置３７℃中和１ｈ，加入细胞悬液１００μＬ（３×１０５个细胞／ｍＬ），置３７℃二氧化碳培养箱培养。６．２．２．４　结果判定当病毒对照在１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ～３００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ出现ＣＰＥ，阴性、正常细胞对照成立时，才能进行判定。判定时间从２４ｈ～１６８ｈ。经１∶１０稀释的鹿流行性出血病某型标准阳性血清能与病毒中和，使５０％以上的细胞不出现ＣＰＥ者判为阳性，即为所鉴定病毒的血清型。７　反转录聚合酶链式反应（犚犜犘犆犚）７．１　试剂和材料７．１．１　引物根据ＮＳ１蛋白编码基因Ｍ６保守序列设计，其引物序列如下：引物Ａ：５’ＴＣＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＣＧＣ３’；引物Ｂ：５’ＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧ３’；扩增产物为３８８ｂｐ引物Ｃ：５’ＣＡＴＧＣＧＧＣＡＴＡＴＡＧＡＴＴＧＧＣ３’；引物Ｄ：５’ＧＴＣＡＴＣＴＡＧＣＡＣＧＡＴＧＣＧＴＧ３’；扩增产物为２２５ｂｐ７．１．２　反转录试剂Ｔｒｉｚｏｌ，ＡＭＶＲＴ（１３Ｕ／μＬ），ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ），犜犪狇ＤＮＡ酶（５Ｕ／μＬ），ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ缓冲液，氯化镁（ＭｇＣｌ２，２５ｍｍｏｌ／Ｌ），电泳缓冲液（ＴＢＥ，配制见附录Ｃ），溴化乙锭溶液（１０ｍｇ／ｍＬ，配制见附录Ｃ），ＤＥＰＣ水（配制见附录Ｃ），琼脂糖，ＤＮＡ分子量标准，随机引物（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）。　７．１．３　样品的采集与前处理７．１．３．１　采样采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。４犛犖／犜１１６１—２０１０７．１．３．２　取样工具棉拭子、剪刀、镊子、研钵、离心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管）。所有取样工具应经１．０１×１０５Ｐａ，１５ｍｉｎ高压灭菌并烘干。７．１．３．３　采样方法７．１．３．３．１　组织样品用无菌的剪刀剪取待检样品２．０ｇ于研钵中充分研磨，再加１０ｍＬＰＢＳ混均，或置于组织均浆器中，加入１０ｍＬＰＢＳ均浆，然后将组织悬液转入无菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液转入另一无菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中